泛生子依托核心荧光定量PCR（qPCR）、数字PCR（dPCR）及高通量测序等平台提供分子诊断整体解决方案。现推出“泛谈-分子诊断”专栏，旨在与每一位致力于分子诊断应用发展的伙伴共同梳理技术发展脉络、探讨临床转化应用、推动检验发展，为更多病患提供精准诊疗方案。 近期主题我们将继续梳理分子诊断技术，主要围绕基因测序方向，逐一介绍测序技术&测序仪的发展、原理及操作等。今天我们讨论第二代测序技术—Illumina测序。 Illumina测序是以“桥式PCR”和“可逆末端终止”作为其核心技术的边合成边测序技术。主要有4个步骤：DNA文库制备—Flowcell吸附—桥式PCR扩增—测序—结果判读。
图1 illumina测序反应示意图[1] DNA文库制备（以靶向测序为例） 1. DNA片段化 第二代测序技术平台读长相对较短，因此样本中提取的基因组DNA需利用超声波将其打断成200-300bp的长度后进行测序，而提取的游离DNA片段长度为50-200bp，无需被打断。[2]（图2A） 2. 末端修复、加“A”尾 片段化的DNA两端呈黏性末端，因此需将其修复成平末端再加入“A”尾，便于下一步添加接头。（图2B、2C） 3. 接头连接 分别在片段化DNA的两端添加测序引物结合位点（Rd1/Rd2 SP区）、标签序列（Index）和特定接头序列（P5、P7）。经过PCR扩增后形成完整的可测序的片段文库。（图2D、2E）
Index：又称barcodes，当一张芯片测多个样本时用于区分不同样本。Index1和Index2用于区分双端测序的结果是否为同一样本。 4. 样本文库质控 通过Qubit荧光计检测文库浓度，Agilent2100/4200生物分析仪检测文库片段的大小。
图2 illumina测序文库制备 Flowcell吸附 Flowcell（流动池）：是一块带有通道的玻片，是测序反应的载体，根据仪器通量大小分成数量不等的通道，每条通道的内表面都包被着两种不同类型的寡核苷酸（oligonucleotides）序列（P5’和P7’）。文库两端P5序列和P5’互补，P7序列和P7’相同。当制备好的单链DNA文库通过Flowcell时，由于文库上P5序列与Flowcell上P5’互补而被牢牢吸附在芯片上。
图3 Flowcell表面分布着两种寡核苷酸序列示意图 桥式PCR扩增 桥式PCR扩增的目的是将目的DNA数量放大，达成测序反应所需信号强度的模板量。
待测DNA文库被吸附到芯片上后，以此为模板进行互补链的延伸，然后模板链被切断并洗去，此时留下的新合成的互补链另一端序列与Flowcell上P7’杂交互补，形成“桥”。以桥型单链DNA（ssDNA）为模板扩增为桥型双链DNA（dsDNA），再将桥型dsDNA变性释放出互补单链，锚定到附近的固相表面再形成ssDNA。经过30轮的扩增-变性循环，最终形成1000拷贝的单克隆DNA簇。桥式PCR扩增结束后，反向链被切割并洗掉，只留下正向链，3’末端被封闭以避免不必要的引物结合和扩增。
图4 Illumina测序桥式PCR过程示意图[1] 测序 1. 测序反应体系 含DNA聚合酶、接头引物、带特异荧光标记的4种dNTP
2. 测序过程—可逆末端终止技术 由于dNTP的3’端有可化学切割的化学基团保护，因此每轮反应只有一个dNTP能与模板DNA链互补配对，其他没有被结合的dNTPs、DNA聚合酶在洗脱过程中去除，在激光的激发下发出荧光，荧光信号被信号接收器采集并记录下来，再加入化学试剂猝灭荧光信号和dNTP3’端的保护，开启下一轮的反应。
图5 Illumina测序过程示意图[3] 测序结果判读 仪器自动读取每轮测序反应记录的荧光信号，经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。如下图根据同一个位置，不同循环读到的碱基序列为CTGA，因此可根据碱基互补配对原则推测出模板DNA链序列为GACT。
图6 Illumina测序结果读取示意图[1] （文中部分图片来源于网络，仅供学习交流，如有不妥，请联系删除） 参考文献 [1] Jay Shendure,Shankar Bal,et al.DNA sequencing at 40:past,present and future [J]. Nature.2017(10):550:345-353 [2] 李金明.高通量测序技术[M].北京:科学出版社,2018 [3] JIA GUO,LIN YU,et al.An Integrated System for DNA Sequencing by Synthesis Using Novel Nucleotide Analogues[J].Acc Chem Res.2010,43(4):551-63 |
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