什么是单细胞测序技术？(下篇)

继人类基因组计划完成之后，科学家们提出了一项人类细胞图谱计划 (Human Cell Atlas)。该计划旨在完成人体中37万亿个细胞的图谱。在这里，单细胞测序技术便成为了该项目的重要推动力。它可以帮助我们区分细胞类型并了解细胞之间的关系，进一步理解在单细胞水平上的生理过程和病理机制，以找到新的诊断标记或治疗靶标，为改善疾病的诊断和治疗提供实践依据。本文将介绍单细胞测序在生殖医学和疾病研究领域的应用。

近年来，中国的不孕不育发生率已上升到12%~15%。世界卫生组织 (WHO) 报道，全球估计共有4,800万对夫妇和1.86亿人患不孕不育症。值得庆幸的是，辅助生殖技术可以有效地解决生育问题。我们知道，生殖细胞和胚胎的正常发育是生命延续的基础。为了降低植入后的胚胎患先天性遗传病的风险，就有必要对植入前胚胎进行检测和诊断。基于对胚胎后期健康发育的考虑，需要同时满足取最小的样本量并检测尽可能全面的遗传信息的要求。而单细胞测序技术，则可专门针对少量胚胎细胞进行精确的基因检测^[1]，并能检出异常的早期胚胎，使在胚胎移植时能够准确、经济地选择正常胚胎，从而有助于预防遗传疾病的发生。

胚胎植入前遗传学检测 (Preimplantation Genetic Screening，PGS)，是为了在胚胎移植到子宫之前，通过检测了解其遗传信息，避免异常胚胎被移植到子宫内。Shang等人^[2]通过MALBAC-NGS方法，对81对夫妇的399个体外受精胚胎进行了单细胞基因组测序，从单细胞水平分析了染色体和线粒体拷贝数，发现了IVF-PGS胚胎中的染色体异常，并发现了孕妇年龄与胚胎非整倍性呈显著正相关的关系。PGS还可以通过选择具有正常核型的胚胎，来降低流产和反复植入失败的风险。另外，Starostik^[3]等人利用单细胞转录组测序的方法，通过整合基因表达的变化和等位基因不平衡的特征，来分析74个植入前胚胎的非整倍性情况，涵盖了E4桑葚胚到E7囊胚晚期共1,115个细胞。在所有细胞类型和发育阶段，80％ (59/74) 的胚胎中至少包含一个非整倍性细胞 (图1)；在74个胚胎中，39% (433/1,115) 的细胞为非整倍性。同时，还发现植入前胚胎的不同细胞类型之间的非整倍性率无显著差异。

图1：人类植入前胚胎的scRNA-seq数据中非整倍性情况^[3]

不管是正常妊娠，还是通过辅助生殖技术进行妊娠，孕妇都要定期进行产检以检测胎儿是否健康。孕妇血液中含有来自胎儿或胎盘的循环细胞，主要是滋养细胞和胎儿有核红细胞。这些细胞提供了比较纯的胎儿基因组DNA，一直被视为无创产前检测 (Noninvasive Prenatal Testing， NIPT) 和诊断的潜在靶标。近年来，也有研究团队在挖掘这些循环细胞的数据，以应用在产前筛查和产前诊断领域。比如，Vossaert等人^[4]从95例孕妇静脉血中，分离出单个循环滋养细胞 (Single Circulating Trophoblast，SCT)，对其进行单细胞低深度全基因组测序和SNP分型，检测胎儿的非整倍性和CNV (~1Mb) 情况 (图2)。在其中44例有羊膜穿刺术诊断结果的孕妇中，33例SCT检测结果与诊断结果一致 (33/44)，3例是限制性胎盘嵌合 (3/44)，8例为SCT检测失败 (8/44)。虽然，目前该方法仍存在不少局限性和挑战 (如滋养细胞富集难度高，每毫升孕妇外周血内此类细胞仅有1~2个，且个体间差异大)，但是这种基于单个胎儿细胞的NIPT，完全排除了母体DNA的干扰，具有成为新的一种NIPT诊断方法的潜力，相信会在未来临床上有更好的应用。

图2：基于单个滋养细胞的NIPT方法可检出非整倍性^[4]

细胞是生物体结构和功能的基本单位。胚胎发育早期细胞的谱系和发育轨迹不尽相同。利用单细胞技术研究早期胚胎发育过程中的细胞，分析其发育轨迹、命运决定、转录和表观调控等特征，对研究个体发育和器官发生具有重要意义。

为了揭示人类早期胚胎的全面转录情况，Petropoulos等人^[5]收集了88个人类植入前胚胎的1,529个单细胞进行转录组测序，发现细胞经历了谱系特异性基因共表达的中间状态，随后建立了滋养外胚层 (TE)、表皮细胞 (EPI) 和原始内胚层 (PE) 谱系，这与囊胚的形成一致。此外，还发现女性胚胎细胞中的这三个细胞谱系 (TE、PE、EPI) 在植入前均达到X染色体RNA水平的剂量补偿；当进行剂量补偿时，X染色体基因保持着双等位基因表达 (图3)。

图3：早期胚胎发育的全面转录情况，揭示了TE、PE、EPI的同时建立以及X染色体剂量补偿的独特特征^[5]

另一方面，DNA甲基化是胚胎发育过程中表观遗传调控的关键。Zhu等人^[6]对50个人类卵母细胞、23个单精子细胞和62个植入前胚胎的480个单细胞，进行了单细胞PBAT DNA甲基化测序，发现在早期发育过程中，全基因组DNA甲基化重编程维持着一种动态平衡的状态——强的全局去甲基化和局部的再甲基化。其中精子细胞，在全基因组范围内呈现高甲基化水平，但卵细胞则相对较低，一旦受精之后，DNA甲基化水平迅速降低，到囊胚阶段降到最低，而在胚胎着床之后全基因组又呈现出非常高的DNA甲基化水平 (图5)。此外，父系基因组的去甲基化比母系基因组的去甲基化，要快得多和彻底得多。因此，可以通过DNA甲基化分析，来追踪早期囊胚的遗传谱系。总之，此工作为破解早期人类胚胎DNA甲基化重编程的秘密，铺平了道路。

图5：胚胎不同发育阶段的DNA甲基化动力学^[6]

单细胞测序技术允许在复杂的混合细胞群体中区分所有细胞类型，可以确定单个细胞的整体基因表达谱，有助于对以前隐藏的细胞群体异质性进行分析。随着单细胞测序技术的不断更新和发展，复杂器官和组织的单细胞研究对于临床疾病的诊断和治疗，正在发挥越来越重要的作用。目前，单细胞测序在肿瘤、神经系统疾病、生殖和遗传病、免疫疾病上应用广泛^[7,8]。

以脑肿瘤为例，脑肿瘤是导至儿童癌症发病和死亡的主要原因。目前的证据支持，儿童时期脑肿瘤病因是较为脆弱的细胞类型中的基因突变破坏了发育基因的表达程序，最终导至肿瘤发生。但是，目前人们尚未全面认识胎儿脑部的发育情况，特别是脑桥。因此，Jessa等人^[9]利用发育中的小鼠脑桥和前脑 (E12.5~P6) 以及产前人类脑干 (17~19孕周) 的单细胞转录组数据，分析了超过65,000个细胞 (61,595只小鼠、3,945个冷冻保存的人类细胞)，确定胚胎和儿童中大脑区域的发育情况，并从分子水平上鉴定和描绘了这些区域的细胞类型及其分化动态。该研究总共鉴定了54种细胞类型，结合对前脑的高分辨率剖面分析，揭示了主要神经细胞谱系分化过程中细胞的转变。大量肿瘤转录组对比分析显示，每种肿瘤类型都表现出不同的特征，ETMR (多层细胞菊形团胚胎性肿瘤)、WNT MB (WNT亚型髓母细胞瘤)、ATRT (非典型畸胎瘤样/横纹肌样瘤) 和H3K27M HGG (高级别胶质瘤) 在空间和时间上具有不同的发育起源。此外，将特定神经祖细胞分化受损作为儿童癌症的共同机制，为未来的建模和治疗干预提供了一个合理的机制。