泛癌早筛：组织溯源TOO综评

最近看了Gene Solutions在Journal of Translational Medicine最新发表的关于TOO文章，解读一下该文章并着重介绍一下TOO：

TOO全称Tissue of origin，即组织溯源，泛癌早筛第二步模型的目标（不了解泛癌早筛模型的可参考甲基化泛癌早筛—Grail是如何建模的？）。

现在市场上泛癌早筛产品开发主要基于两个路线：甲基化靶向测序（参考国内泛癌早筛产品梳理之甲基化靶向测序篇）和low-pass WGS/WGBS（参考国内泛癌早筛产品梳理之低深度全基因测序篇）。

首先看一下基于甲基化靶向测序泛癌早筛产品的组织溯源性能：

Grail的泛癌早筛产品Galleri已经写过多次了，其覆盖了50多个癌种，虽然组织溯源时将有些相近部位的癌种分为了一组, 但至少也有20多个不同的部位:

按20多个不同的溯源部位来算，随机预测成功的概率不到5%，但是Galleri的组织溯源模型能将TOO准确率从随机的5%提升到90%左右。

覆盖的癌种越少，随机预测的准确率越高，组织溯源难度应该越低，上表总结的国内的这三个使用相同技术路线的产品，覆盖的癌种数目远远少于Grail，TOO本该更好才对，但是即使在回顾研究的训练集样本中都难以达到Grail的水平，仍需努力。

再看一下基于low-pass WGS/WGBS 技术路线泛癌早筛产品的TOO性能：   

前面已经介绍过Gene Solutions的泛癌早筛产品SPOT-MAS（越南也有泛癌早筛！！并且还不差！！），并进行了大规模的前瞻性临床验证（亚洲第一个？Gene Solutions 万人前瞻性泛癌早筛临床实验结果）。

估计Gene Solutions对比Grail 90%左右的TOO准确率，感觉原模型效果不行，然后进行了各种测试并发表了开头说的文章：

文章中Gene Solutions首先从5个癌种（越南前5大高发癌种：乳腺癌，结直肠癌，胃癌，肝癌，肺癌，另外还包括了WBC）组织WGBS数据（测序深度5-15x）中筛选甲基化区域。

一共筛选到了2945个低甲基化区域（每个组织 vs 其它组织选Top 500 markers），下面热图中明显看到这些marker在5个癌种及WBC样本中具有显著的差异：

为什么只选低甲基化区域呢？

Gene Solutions参考了2023年发表在Nature上的一篇文章：

大概讲一下这篇文章：其使用来源于205个不同个体的39种不同细胞类型的WGBS数据来筛选细胞类型特异性的甲基化marker，发现最后筛选到的甲基化marker中：

细胞类型特异性的高甲基化marker富集于CpG岛区域，但是很少；细胞类型特异性的低甲基化marker富集于增强子区域，很多。   

这个和前面讲过的Grail筛选的marker也是比较一致的（参考甲基化标志物筛选：Grail VS 燃石），Grail主要使用WGBS的数据进行甲基化marker筛选，最后筛选出的低甲基化CpG位点也是更多的。

只是Grail没有把癌症鉴别的marker和组织溯源的marker的分开统计，如果分开统计的话，预估组织溯源marker中低甲基化marker占比更高。

继续，Gene Solutions筛选到2945低甲基化TOO marker后，再使用非负最小二乘矩阵分解法（简称NNLS）来确定目标样本中不同组织的占比。   

NNLS怎么做的？

NNLS是一种用于解决非负矩阵分解问题的方法。它的主要思想是在给定一个矩阵A和向量b的情况下寻找一个非负向量x，使得Ax与b的差异最小化。

具体到该文章：

矩阵A就是筛选出的这2945个甲基化区域在上述组织WGBS数据的甲基化水平，相当于做了一个参考矩阵；

向量b就是目标样本在这2945个甲基化区域中的甲基化水平；

非负向量x是待求的目标向量，x向量中的数值就是上述5个癌种+WBC的系数（文章中称为Deconvolution scores），即对目标样本进行了分解，可看做目标样本中5个癌种+WBC的组成比例，组织溯源结果就是最大系数所对应的癌种。

后续Gene Solutions将此方法在以下4个不同的数据集中进行了验证：

组织样本TCGA甲基化芯片（450k/850k）数据集：

2945个目标甲基化区域，只有1088个和甲基化芯片的数据有交集，基于这1088个甲基化区域，同样使用NNLS的方法。

TOO准确率可达到78%左右，达到这程度也可以了，毕竟不同的技术平台，说明筛选的这些marker在不同的数据集中都是有TOO信号的：

计算机和湿实验分别模拟的不同癌种不同ctDNA占比的数据：

在不同的癌种中，都是随着ctDNA占比的升高，NNLS分解的对应癌种的分值也越来越高，除了湿实验模拟的CRC，其他都显著相关，并且R值都在0.72以上，也是符合目标的。

最关键是真实临床cfDNA样本WGBS数据的验证：真正临床应用时测序深度只有0.5x。   

上述的方法（即上图中的DS-Only）在cfDNA样本中整体的准确率只有0.26，比随机预测的准确率（20%）就高了一点。。。说明该方法在实际的临床cfDNA样本中效果还很差，也可理解，毕竟才0.5x，区域也就不到3000个。

然后Gene Solutions遍历测试了不同特征组合模型的效果，使用的特征包括：

DS（即刚才讲述的2945个区域NNLS的方法），GWMD（基因组水平甲基化水平），TMD（450个靶向甲基化区域的甲基化水平），CNA（拷贝数），EM（endmotif，片段末端基序），GWFP（基因组水平片段化特征）等等（前面说到过其中一些特征：越南也有泛癌早筛！！并且还不差！！）。

总之你能想到的几乎所有特征Gene Solutions都有纳入，并使用了深度学习GCNN（图卷积神经网络模型）模型进行整合。

Gene Solutions做的很多很全了。   

最后遍历的结果是DS+GWMD的TOO准确率最高，可以达到0.69左右，最后那一堆片段组学特征竟然都没用到。。。

再综合一下现有的基于low-pass WGS和WGBS的泛癌早筛产品的两个大规模前瞻性验证的结果：

Gene Solution 5个癌种组织溯源准确率只有64%（亚洲第一个？Gene Solutions 万人前瞻性泛癌早筛临床实验结果），和此次新发表文章结果差别不大。

世和基因low-pass WGS的泛癌早筛产品：13个癌种组织溯源准确率为61.5%（世和基因泛癌早筛最新结果）。

比起Grail都还差的远。。。

总结：

甲基化靶向测序的路线有Grail在前面打样，组织溯源准确率在20+部位中都能达到90%左右，国内相同路线产品虽然还达不到Grail的水平，但至少心里有底，未来还是有机会可以达到的。

但是low-pass WGS/WGBS的路线的泛癌早筛产品现在看来TOO的天花板比较低，TOO准确率堪忧。

最后也希望未来被打脸吧，毕竟多一个路，就会有更多人获益。