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Q30提升至Q40后，测序准确率可以提升多少？(I)

2024-2-19 15:22| 编辑: 归去来兮| 查看: 1508| 评论: 0|来源: 基因Share | 作者：冯宝省

摘要: 测序数据质量从Q30提升至Q40后，测序准确率可以提升多少？

测序数据质量从Q30提升至Q40后，测序准确率可以提升多少？这是一个最近比较热门的话题。我们今天还是以Illumina的NovaSeq系列测序仪为例，来简单讲解。

该主题内容共分为I和II 2 篇文章，主要内容:

▲1.NovaSeq 6000和NovaSeq X的Q Score Bin。(I)

▲2.Q30的NovaSeq 6000和Q40的NovaSeq X的测序错误率在什么水平？(I)

▲3.Q40可能带来哪些应用性能提升？(II)‍‍‍‍‍‍

主要结论见文末。‍‍‍‍‍

▲1.NovaSeq 6000和NovaSeq X的Q Score Bin

在《测序仪 Q 值评分体系准确性评估方法简介》一文中我们介绍了Q Score Bin 的相关知识，目前 illumina的 NovaSeq、NextSeq、iSeq 和 HiSeq X的 Q Score 体系均采用了划Bin 的方案（即,将连续的Q Score 划分为几个区块，每个区块选定 1 个 Q Score作为代表）。

2023 年10 月Illumina宣布，基于XLEAP-SBS，NovaSeq X系列和NextSeq1000/ 2000 在升级特定软件版本后将实现≥85%bases≥Q40的数据输出。

上表统计了 NovaSeq 6000 和 X 系列在软件升级前、后的 Q Score Bin组成，两款产品均采用了1(no call)+低、中、高3区间的体系，非常方便我们开展对比。

NovaSeq X v1.2软件更新通知(部分内容)：

1.Illumina 描述在测序化学和芯片设计上无任何变更，碱基识别软件RTA更新了Q值表，更新后的Q值表更接近真实的数据质量（observed Q Score）表现。(Illumina认为 V1.0/1.1 软件的Q Score打分存在虚低)‍

2. 如上图所示，NovaSeq X Q Score 3 区间中，High-quality bin赋值从Q37更新为Q40(代表Q30~43)，Medium-quality bin 从 Q20 更新为 Q24(代表Q18~29)，这意味着更新后，NovaSeq X Q Score≥30和≥40的值仅有 1 个，即40，也即 ''≥Q30%''=''≥Q40%''。

▲2.Q30的NovaSeq 6000和Q40的NovaSeq X的测序错误率在什么水平？

我们默认NovaSeq X更新Q值表后的打分是准确的，那≥85%≥Q40的NovaSeq X与≥85%≥Q30 的NovaSeq 6000相比，测序错误率下降了多少呢？

我们需从2个统计角度开展数据整体错误率的计算。

1.统计所有Q Score bin 的bases

2.仅统计High-quality bin 的bases

▲统计所有Q Score bin 的bases。为方便计算我们假设测序数据中共10000个bases。

NovaSeq 6000 ≥90%bases≥Q30，≥98%bases≥Q20 （依托实测数据设定）。

90% Q37(ER～0.02%)，9000×0.02%=1.8个 error bases‍‍‍‍‍

8% Q25(ER～0.316%)，800×0.316%=2.5个 error bases

2% Q11(ER～7.943%)，200×7.943%=15.9个error bases

error_bases(1.8+2.5+15.9)/all_bases(10000)=0.20%

NovaSeq X ≥90%bases≥Q40，≥98%bases≥Q20 （依托实测数据设定）。

90% Q40(ER～0.01%)，9000×0.01%=0.9个error bases

8% Q24(ER～0.398%)，800×0.398%=3.2个error bases

2% Q12(ER～6.310%)，200×6.310%=12.6个error bases

error_bases(0.9+3.2+12.6)/all_bases(10000)=0.17%

当统计所有Q Score bin 的bases时，X相比6000的数据整体错误率下降了15%。

另外可以看到，低Q Score bases以及其现阶段的占比水平显著影响了数据整体错误率水平，以下示例可以进一步辅助大家理解这点。

示例：某型号测序仪测序数据共 1110 个 bases，其中 Q30 bases 1000 个，Q20 bases 100 个，Q10 bases 10个。

90% Q30(0.1%),1000×0.1% =1.0个
9% Q20(1.0%), 100 ×1.0%=1.0个

1% Q10(10%), 10×10.0%=1.0个

error_bases(1.0+1.0+1.0)/all_bases(1110)=0.27%

如 Q10 bases 占比+1%,Q20 bases-1%,则数据整体错误率将上升至 0.37%。

▲如仅统计High-quality bin 的bases

虽然现阶段低Q Score bases的占比水平会显著影响数据整体错误率水平，但在应用端数据分析时，高 Q Score bases 将被赋予更高的权重甚至分析流程会规定仅Q Score≥XX的base才会被纳入分析。

所以，仅使用High-quality bin的bases来评价测序数据质量是必要且合理的， NovaSeq X相比NovaSeq 6000，即Q40（≥90% bases）比Q37（≥90%bases）错误率从0.02%下降至0.01%，即降低了100%或1倍。

▲仅统计High-quality bin 的bases，如果NovaSeq X相较于NovaSeq 6000要实现3X的测序错误率的下降（前期XLEAP-SBS 宣传材料中，Illumina 提及的Accuracy increase 3X），则High-quality bin的代表值需要从 Q37 提升至 Q43。如期望实现10X测序错误率的下降则High-quality bin的代表值需要从 Q37 提升至 Q47.5。

综上，我们可以初步得出以下结论：

▲在 Q 值打分体系准确的前题下，测序数据质量从 ''≥85%bases≥Q30''级别提升至''≥85%bases≥Q40''级别，需先明确Q值提升的''起点''和''终点''，才能确定测序错误率的降低程度。例如从NovaSeq 6000的Q37到 NovaSeq X的Q40，错误率下降约1X（仅统计High-quality bin的bases & Q值评分体系准确）。‍‍‍‍‍

目前，在市场宣传层面，大家喜好默认''Q30 级别数据''的Score起点为30且仅有30，进而宣传Q40级别数据的错误率实现了数量级的下降。‍‍

▲低Q Score bases以及其现阶段占比显著影响了数据整体错误率水平,例如Q10水平的 bases 占比仍在 1～2%水平不降低，即使高Q Score bases错误率降低至 0%，数据整体错误率仍将在1%×10%～2%×10% 即 0.1～0.2%的水平。‍‍

所以，数据整体错误率的下降，低Q Score bases占比的降低也是关键。

以上即为今天分享的全部内容，我们后续将为大家讲解 Q 值的提升对下游应用的影响。

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