【专家论坛】血液标志物对阿尔茨海默病诊断价值的再认识

一、AD及其血液标志物

AD是一种进展性神经系统退行性疾病，分为临床前期、轻度认知障碍期（mild cognitive impairment，MCI）以及痴呆期。AD的发生是多系统紊乱的结果，其病因十分复杂，存在多种假说，包括Aβ蛋白级联假说、tau蛋白过度磷酸化假说、神经炎症假说、胆碱能假说以及金属离子紊乱假说等，这些假说的提出从各自角度解释了AD的发病机制，同时也为AD的诊断提供了更多可靠的生物标志物。

脑组织中Aβ蛋白沉积形成淀粉样斑块和tau蛋白过度磷酸化是AD的主要病理特征，淀粉样斑块过量产生或清除障碍均会导至Aβ肽链聚集成为寡聚体，进而引起神经细胞离子通道受阻、钙稳态改变及线粒体氧化应激增加等一系列病理改变。而作为一种微管相关蛋白，tau蛋白的过度磷酸化将导至自身微管结构破坏和神经退行性病变，进而引起神经纤维缠结，最终导至神经元之间信号处理异常和神经元细胞的凋亡。脑脊液中Aβ42、Aβ-40、p-tau等可以直接反映AD的病理改变，目前已被纳入AD的诊疗指南。与脑脊液相比，血液检测更具优势，血清神经源性外泌体（neuronally-derived exosome，NDE）中的Aβ、tau蛋白可以自由穿过血脑屏障进入外周血且不受机体内其他因素的干扰，因此可更加精确地反映AD患者脑组织的神经病理改变^［4］。近年来随着超敏检测技术的应用，Aβ、p-tau等传统标志物在血液中的价值被进一步发掘，有可能取代脑脊液检测成为AD早期诊断的新方法。

神经炎症被认为是继Aβ沉积和神经纤维缠结之后的AD第三大病理特征。AD患者脑组织中Aβ蛋白聚集导至小胶质细胞过度激活，通过释放促炎因子来吞噬Aβ蛋白，若Aβ蛋白持续增加，超过小胶质细胞的清除能力，则会促发炎症细胞因子的大量释放，导至神经炎症和神经毒性，引起认知功能损伤^［5］。除小胶质细胞介导的固有免疫参与AD神经炎症过程外，适应性免疫如T、B淋巴细胞等在AD的发病过程中也发挥了重要作用^［6］，通过检测血浆中的炎症因子、补体及淋巴细胞等免疫相关因子可进一步反映AD的病理改变。

中枢神经系统退行损伤是AD的又一重要病理特征。神经丝蛋白轻链（neuroflament protein light chain，NfL）是构成神经元轴突中间纤维的特异性蛋白，是神经元细胞骨架的重要成分，其异常表达与神经系统疾病的发生、发展密切相关^［7］。在AD患者早期的病理改变中，中枢神经系统发生退行性改变，一方面引起NfL升高，另一方面引起反应性星形胶质细胞增多，进而导至胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的过度表达^［8］，因此检测血浆中NfL和GFAP的水平可反映AD早期的神经病理损伤情况。

二、血液标志物在AD中的诊断价值

（一）血浆Aβ42/Aβ40

Aβ蛋白主要包括Aβ40和Aβ42，目前，多数学者认为在AD的诊断中，相较于单独检测Aβ40或Aβ42，血浆Aβ42/Aβ40有着更高的诊断价值。Ovod等^［9］运用LC-MS/MS检测Aβ42和Aβ40在认知未受损者和AD患者血浆中的表达水平，发现在AD患者血浆中Aβ42/Aβ40的比值降低，且该比值低的认知未受损者未来发生淀粉样变性的概率约为89%。Pérez-Grijalba等^［10］研究发现与认知未受损者相比，MCI患者血浆中Aβ42/Aβ40比值降低，该组患者2年内进展为痴呆期的风险增加约70%。除了在痴呆期患者血浆中差异表达外，Aβ42/Aβ40在AD临床前期的诊断中也具有一定价值，如Verberk等运用单分子免疫技术检测血浆中Aβ42和Aβ40，发现在Aβ⁺的受试者血浆中Aβ42/Aβ40显著低于Aβ^-受试者^［11］，且Aβ42/Aβ40对于这2组的鉴别有着较高的敏感度（90%）和特异度（80%）^［12］。中国阿尔茨海默病痴呆诊疗指南（2020年版）指出：血浆Aβ42/Aβ40比值降低定义AD痴呆和MCI的性能高，其区分AD和MCI与健康对照的合并敏感度和特异度分别为0.85和0.97，AUC为0.92^［13］。

（二）血浆p-tau蛋白

根据磷酸位点的不同，p-tau主要有p-tau181、p-tau231、p-tau217等，其中p-tau181可以较精确反映脑组织内神经纤维缠结的负荷情况，并且与海马体萎缩等AD的早期病理改变有着密切联系，因此对于早期AD具有较好的提示作用。近年来，随着超敏检测技术的应用，血浆p-tau181在AD诊断中的价值被进一步肯定，其在MCI及AD痴呆患者血浆中的表达水平显著高于认知未受损者^{［14, 15, 16］}，且血浆p-tau181高表达的认知未受损者（或MCI患者）进展为痴呆期的几率更高^［17］，因此可用于AD疾病进展的监测。此外，研究者还发现血浆p-tau181^［18］和p-tau231^［16］在认知未受损的Aβ⁺受试者中的表达水平显著高于认知未受损的Aβ^-受试者，进一步表明了两者在AD临床前期诊断中的价值。除了临床前期，血浆p-tau231在AD临床期诊断中也有着较高的价值，有研究认为相对于Aβ^-认知未受损者，p-tau231在AD患者血浆中显著上调，诊断AUC为0.92~0.94，而在鉴别痴呆期与Aβ^-的MCI时，AUC为0.89^［19］。相较于p-tau181和p-tau231，血浆p-tau217可以更早提示AD的发生^［20］，Palmqvist等^［20］的研究发现PSEN1 E280A突变携带者血浆p-tau217水平随年龄增长而升高，在24.9岁时与非携带者出现明显差异，这比突变携带者出现轻度认知障碍的时间提前了约20年，可见p-tau217在AD患者的临床前期就已经升高^［21］，且这种变化发生于PET（正电子发射型计算机断层显像）检测出tau阳性之前^［22］。在鉴别AD与非AD方面，血浆p-tau181、p-tau231及p-tau217同样表现突出，诊断AUC分别为0.94^［23］、0.93^［19］和0.96^［20］。

（三）血液神经退行性相关蛋白

NfL可直接反映神经元退行性损伤情况，其在脑脊液和血液中相关性很好（r值为0.70~0.97），是第一个被证实具有临床价值的神经特异性生物标志物^［24］。NfL对家族性AD具有较好的预测价值，Preische等^［25］的研究发现，相对于未突变者，携带AD相关基因（APP、PSEN1、PSEN2）突变的AD高风险人群在认知障碍发生前6.8年其血清NfL水平就已经显著升高，其中PSEN1 E280A突变携带者血清NfL的升高要更早（22年前）。另有研究认为血浆NfL在Aβ⁺认知未受损者中的表达水平显著高于Aβ^-认知未受损者^［18］，表明血浆NfL对于散发性AD也有一定的提示作用。另外，MCI患者血浆NfL水平与其认知能力呈负相关，且高表达NfL的MCI患者更易进展为痴呆期^［25］。1项历时11年的多中心队列研究表明：相对于认知未受损者，血清NfL在MCI和痴呆期患者中均上调表达，它在认知未受损者中的平均值为32.1 ng/L，MCI为37.9 ng/L，痴呆期为45.9 ng/L，其对痴呆期的诊断价值最高，AUC为0.87^［26］。

GFAP是另一种反映AD早期神经病理损伤的标志物，Stocker等^［27］对768名受试者进行了长达17年的跟踪随访，发现进展为AD的受试者在确诊前9~17年，血浆GFAP水平就已经显著升高，这种变化要早于p-tau181和Nfl，而与稳定型MCI患者相比，之后进展为痴呆期的MCI患者的血浆GFAP出现明显的纵向增长^［28］。此外，血浆GFAP水平与AD患者的认知水平呈反比，血浆GFAP高水平表达的AD患者，其记忆评分显著低于GFAP低表达的AD患者^［29］。由于血浆中NfL和GFAP的含量偏低，酶联免疫法和化学发光法难以测出，因此目前的研究大多选择灵敏度更高的SiMoA方法。

（四）免疫相关因子

人体免疫系统失调所导至的神经炎症反应是AD的早期事件^［30］，炎症因子释放、免疫细胞浸润以及补体系统的异常激活在AD的发生发展过程中扮演着重要角色。

1.神经炎症因子：在AD发病早期，Aβ和APP（淀粉样前体蛋白）通过诱导小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元释放炎症因子，而炎症因子的释放进一步促进了Aβ沉积，形成恶性循环。目前研究较多的炎症因子有C反应蛋白（C-reactionprotein，CRP）、白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-12等。其中，CRP作为炎症反应的明星分子，其在AD中的诊断价值受到研究者的广泛关注。一直以来，对于CRP在AD患者血浆中的表达情况并无一致结论，然而最近Krance等^［31］的荟萃分析认为，与健康受试者相比，CRP在AD患者外周血中上调表达，有望成为AD的诊断标志物。近年来IL-1、IL-6和TNF-α在AD中的表达情况仍存在不确定性^［32］，矛盾结论的出现或许与AD神经炎症内环境的紊乱有关。另外，炎症相关因子血清可溶性髓样细胞触发受体2（soluble triggering receptor expressed on myeloid cells 2，sTREM2）也参与了AD的神经炎症过程，它在AD患者大脑中上调表达并通过激活炎症反应而致病。研究表明：AD患者外周血单核细胞中的sTREM2无论在mRNA水平还是蛋白水平都显著高于对照组^［33］，且与AD的发病风险正相关。Zhang等^［34］最近的研究发现，sTREM2在AD患者和认知未受损者血清中差异表达，其对AD的诊断敏感度较高为81.8%，AUC为0.677 3。

2.免疫细胞在AD中的诊断价值：神经炎症诱导的免疫细胞浸润是AD的特征之一，在AD的发病过程中，小胶质细胞、神经元或内皮细胞释放的促炎细胞因子和趋化因子可将外周单核细胞和T淋巴细胞等吸引到中枢神经系统，进而靶向调节Aβ蛋白的形成^［36］。既往的研究认为，AD患者外周血中淋巴细胞和嗜碱性粒细胞数量减少，而中性粒细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞则无明显变化^［35］。近年来，随着检测方法的提高以及研究的进一步深入，越来越多的研究者将目光投向了T淋巴细胞亚群在AD诊断中的价值，他们发现AD患者外周血中的CD4+T淋巴细胞水平升高^［6］，且升高程度与AD患者的认知缺陷密切相关^［36］。然而，AD患者外周血中CD8+T淋巴细胞的作用存在一定争议，既往的研究认为CD8+T淋巴细胞在AD外周血中升高^［37］，而最近Xu和Jia^［6］的研究发现CD8+T淋巴细胞在AD外周血中水平降低，这进一步揭示了AD发生过程中T淋巴细胞调节紊乱所导至的中枢神经系统免疫微环境恶化。除T淋巴细胞外，其他免疫细胞在AD的发病中也发挥了一定的作用，如Wang等^［38］最近的研究发现：相对于健康对照，AD患者外周血中静息自然杀伤细胞、M0巨噬细胞以及活化肥大细胞的水平升高。由此可见，外周血免疫细胞的功能障碍可能是导至中枢神经系统免疫环境恶化的因素之一，检测外周血免疫细胞及其亚群对AD的诊断具有一定的指导意义。

3.补体在AD中的诊断价值：补体系统是人体先天免疫反应的重要组成部分，多种补体分子在AD的发病过程中发挥着重要作用。目前研究较多的补体有：补体因子H、凝聚素、血浆因子Ⅰ、C4d和iC3b等^［39］，其中凝聚素在AD中的作用备受研究者关注，既往的研究认为凝聚素是AD发病的风险因素之一，其在AD和MCI患者血浆中表达上调^{［40, 41］}，且在进展型MCI患者血浆中的表达水平显著高于稳定型MCI^［39］。另有研究认为凝聚素在AD发病过程中发挥着神经保护的作用，它作为伴侣蛋白可改变Aβ蛋白的聚集性和毒性，以达到清除Aβ蛋白的目的^［42］。然而随着研究的逐渐深入，凝聚素对于AD的诊断面临挑战，如最近一篇综合了20项研究的荟萃分析认为：与健康对照相比，凝聚素在AD患者血浆中差异无统计学意义^［31］。除凝聚素外，其他补体分子（如C3、C4、C1-抑制子）也参与了AD的炎症反应过程，而最新的研究发现C1q、C4a、C9在AD患者血浆中呈上调表达^［31］，进一步揭示了补体分子在AD诊断中的意义。

（五）血液神经源性外泌体蛋白

超敏检测技术的运用显著降低了基质效应对Aβ检测的影响，提高了Aβ蛋白检测的灵敏度，然而由于血液中非脑组织来源的Aβ蛋白（如血小板中的Aβ蛋白^［43］）对检测结果的干扰，检测特异性还有待进一步提高。NDE可自由穿越血脑屏障而不受外界干扰，因此可以更加准确反映AD大脑组织的神经病理改变，Jia等^［44］发现Aβ、tau蛋白在外周血NDE和CSF中的表达高度相关，且AD患者外周血NDE中的Aβ42、t-tau和p-tau181的表达水平显著高于遗忘性轻度认知障碍患者及健康对照，其诊断效能可与CSF相一致。突触功能障碍及丢失是AD发生的早期事件，与AD患者的认知功能下降有着密切联系^［45］，突触相关蛋白Neurogranin、SNAP-25、synaptotagmin1、GAP43在AD患者血浆神经源性外泌体和脑脊液中的表达具有相关性，它们在AD患者血浆NDE中下调表达，四者联合检测可将AD的诊断提前5~7年^［46］。

（六）血液中微小RNA（microRNA，miRNA）

MiRNA与神经细胞的发育、分化和突触可塑性相关，并参与包括AD在内的多种神经退行性疾病的发生发展，约70%的miRNA位于大脑内^［47］，它们通过血脑屏障进入外周血，进而间接反映不同的神经病理变化过程。MiRNA可通过靶向调控APP、Aβ和tau相关基因，进而影响AD的发生发展，如miR-29c通过靶向调控BACE1调控Aβ蛋白沉积^［48］，miR-200a-3p通过调控BACE1和PRKACB以保护神经元免受Aβ蛋白毒性和tau蛋白过度磷酸化的影响^［49］。Tan等^［50］的研究发现，miR-98-5p、miR-885-5p、miR-483-3p、miR-342-3p、miR-191-5p和miR-let-7d-5p在AD患者和健康对照人群血清中表达有差异，其中miR-342-3p在鉴别AD时有较高的特异度（70.1%）和敏感度（81.5%）。然而单一miRNA对于AD的诊断效能往往低于多种miRNA的联合检测，Leidinger等^［51］检测了12个神经相关的血浆miRNA，它们鉴别AD患者与认知未受损者的准确率为93%，鉴别AD与其他神经系统疾病的准确率为74%~78%。

与血清中游离的miRNA相比，血清神经源性外泌体中的miRNA较少被降解，能更加准确地反映AD患者神经细胞及脑组织的状态，因此有望成为AD的新型诊断标志物。有学者发现血清神经源性外泌体中miRNA-135a、miRNA-193b、miRNA-384在AD的诊断中具有较大价值，且三者联合检测对AD的诊断价值要高于单一miRNA^［52］。Lugli等^［53］的研究发现20个miRNA在AD患者血清外泌体中差异表达，其中miR-342-3p的差异最为明显，它在AD患者的血清外泌体中下调表达^［54］，并且与MMSE认知评分相关^［55］，因此有望成为AD发生的预测指标。

三、展望

1.超敏检测技术将在AD“传统标志物的再认识”和“新标志物的开发”领域发挥重要作用：近年来，随着SiMoA等超敏检测技术的应用，研究者开始重新审视血液标志物在AD诊断中的意义，最新发布的《阿尔茨海默病源性轻度认知障碍诊疗的中国专家共识2021》^［56］指出血浆Aβ42/Aβ40、p-tau217、p-tau181和NfL可用于AD源性MCI的早期诊断和疾病进展的评估（Ⅱa级推荐，A级证据），进一步肯定了传统血液生物标志物在AD早期诊断中的价值，同时也为AD新型血液标志物的开发带来了希望。

2.多个血液标志物联合检测是未来AD诊断的发展方向：AD的发生发展是一个极其复杂的过程，涉及神经、血液、免疫及肠道微生态等多个系统，单一生物标志物难以描述AD的全部病理过程，大量研究认为多个血液标志物的联合检测可显著提高AD的诊断效能，因此寻找特异度强、敏感度高的血液标志物组合将成为未来AD的研究热点。

参考文献（略）