免疫胶体金技术及其在检验检疫中的应用

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免疫胶体金技术就是免疫金标记技术(Immuno2goldlabellingtechnique),自1971年Faulk和Taytor将胶体金引入免疫化学后,免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法,因具有简单、快速、准确和无污染等优点,在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogoldfiltrationassayDIGFA),本文对这两种方法作以具体介绍,以期检验检疫中借鉴采用。
1 免疫胶体金技术的基本原理

胶体金是利用氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水胶溶液,由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金标记就是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理是胶体金颗粒表面的负电荷与蛋白质的正电荷基团静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽等非共价结合,因而在基础研究和检验检疫中成为非常有用的工具。免疫金标记技术主要利用了金颗粒具有高电子高密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点。因而被用于定性或半定量的快速免疫检测中,这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大,称之为免疫金银染色。
2 胶体金的制备常用方法

胶体的制备一般采用还原法,常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。2.1柠檬酸三钠还原法制备金溶胶取0.01%氯金酸水溶液100mL加热至沸,搅动下准确加入1%柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)水溶液0.7mL,金黄色的氯金酸水溶液在2min内变为紫红色,继续煮沸15min,冷却后以蒸馏水恢复到原体积,如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在535nm,Alcm/535=1.12。金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关,一旦颗粒大小发生变化,光散射也随之发生变异,产生肉眼可见的显著的颜色变化,这就是金溶胶用于免疫沉淀或称免疫凝集试验的基础。金溶胶颗粒的直径与制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的,保持其他条件恒定,仅改变加入的柠檬酸三钠量,可制得不同粒径的金溶胶,也就是不同颜色的金溶胶,见表1。
2.2 柠檬酸三钠-鞣酸混合还原法

用此混合还原剂可以得到比较满意的金溶胶,操作方法如下:取4mL1%柠檬酸三钠,加入0～5mL1%鞣酸,0～5mL25mmol/LK2CO3(体积与鞣酸加入量相等),以双蒸馏水补至溶液最终体积为20mL,加热至60,取1mL1%的HAuCl4,加于79mL双蒸馏水中,水溶加热至60,然后迅速将上述柠檬酸-鞣酸溶液加入,于此温度保持一定时间,待溶液颜色变成深红色(约需0.5～1h)后,将溶液加热至沸腾,保持沸腾5min即可。改变鞣酸的加入量,制得的胶体颗粒大小不同。
2. 3 白磷还原法在120mL双蒸馏水中加入1.5mL1%氯金酸和1.4mL0.1%mol/LK2CO3,然后加入1mL1/5饱和度的白磷乙醚溶液,混匀后室温放置15min,在回流下煮沸直至红褐色转变为红色。此法制得的胶体金直径约6nm,并有很好的均匀度,但白磷和乙醚均易燃易爆,一般实验室不宜采用。要得到大小更均匀的胶体金颗粒,可采用甘油或蔗糖密度梯度离心,经分级后制得胶体金颗粒直径的变异系数(CV)可小于15%。
3 免疫胶体金的制备

3.1蛋白质的处理:由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附,并可使溶胶聚沉,故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意,蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒,否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在,因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。3.2蛋白质最适用量的选择:将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后,分别取0.1mL(含蛋白质5～40μg)加到1mL胶体金溶液中,另设一管不加蛋白质的对照管,5min后加入0.1mL10%NaCl溶液,混匀后静置2h,不稳定的金溶胶将发生聚沉,能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10%即为最佳标记蛋白量。3.3常见标记步骤:在接近并略高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的,在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。3.3.1用0.1mol/LK2CO3或0.1mol/LHCl调节金溶胶至所需pH(标记SPA时调到pH6.0)。3.3.2于100mL金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液(体积为2～3mL),搅拌2～3min。3.3.3加入5mL1%PEG20000溶液。于10000～100000g离心30～60min,小心吸去上清液。3.3.4将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/mLPEG20000的缓冲液中,离心沉淀后,再用同一缓冲液恢复,浓度以Alcm/540nm=1.5左右为宜,以0.5mg/mL叠氮钠防腐,置4保存
。
3.3.5包被后的金溶胶也可浓缩后于SephadexG-200柱进行凝胶层析分离纯化,以含0.1%BSA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG包被的金溶胶洗脱液pH为8.2,以A蛋白包被的金溶胶洗胶液pH为7.0。以上操作中应注意,一切溶液中不应含杂质微粒,可用高速离心或微孔滤膜预处理。
4 胶体金的稳定性及免疫胶体金贮存

胶体金有很高的动力学稳定性,在稳定因素不受破坏时自身凝聚极慢,可放置数年。影响稳定的因素主要有电解质、溶胶浓度、温度、非电解质等。金溶胶必须有少量电解质作稳定剂,但浓度不宜过高。高浓度亲水性非电解质能剥去胶粒外面的水化膜使其凝聚。少量的高分子物质促使溶胶凝聚,但一定量的高分子物质反而可增加溶胶稳定性,如蛋白质、葡萄糖、PEG20000等的加入有良好的稳定效果。当金溶胶吸附蛋白质后,溶胶的稳定性随溶液pH而变化,这种变化取决于吸附蛋白质的等电点,如ConA、过氧化物酶等,当pH较低时保持稳定,提高pH则显得不稳定,接近等电点或略高时又变得稳定。标记后的胶体金溶液可用0.2～0.5mg/mLPEG20000作稳定剂。在4～10贮存数月有效,不宜冰冻。贮存中可能会发生程度不同的凝聚,可离心除去。
5 免疫胶体金在检验检疫中的应用5. 1 胶体金在免疫层析快速检测技术中的应用
免疫层析法(immunochromatography)是近几年来兴起的一种快速诊断技术,其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带,当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品后,由于毛细管作用,样品将沿着该膜向前移动,当移动至固定有抗体的区域时,样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合,若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色,从而实现特异性的免疫检测。早孕诊断用的免疫层析试纸条(通常又叫尿妊纸条)是一个成功的例子,该法检测速度快,一般1～2min可出结果;灵敏度较高,可达50IU/L;结果准确可靠,在尿妊诊断中得到广泛应用。以其为例,装配方法见图1:在塑料底板上分别将吸尿用玻璃纤维、冻干金标记抗α-HCG玻璃纤维、已固定有抗β-HCG抗体的NC膜及硬质吸水滤纸按图装配,配件与塑料底板的结合可用双面胶或其他黏性材料粘接。装配好的纸板按纵向剪切,裁成宽度为4mm的条状,即为尿妊用纸条。尿妊试纸条的快速特性来源于胶体金免疫层析法的固有特性,与原材料选择特别是NC膜的孔径大小密切相关,准确性取决于β-HCG的特异性。胶体金试纸条用于肉眼水平的免疫检测中,具有以下优点:样品不需要特殊处理,试剂和样本用量极小,样本量可低至1～2μL;敏感性和特异性高,既可用于抗原检测,也可用于抗体检测;时间大大缩短,提高了检测速度;操作简单,不需荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器,更适于现场应用;实验结果可以长期保存。这使其在检验检疫上有很大的应用潜力,可以通过制备单克隆抗体或基因工程抗体,将检疫条约规定的疾病的抗体做成试纸条,直接检测血液、拭子、粪便、组织悬液中的病原体,对于旅客、伴侣动物等不便于长期隔离的个体的出入境检疫在现场就可以完成,检疫结果还能备案。目前在动物疾病诊断中已经使用了细小病毒检测试纸条,如果再将其他传染病的抗体制备成试纸条,技术上是成熟的,方法上是可行的,随着研究工作的开展,胶体金试纸条广泛用于检验检疫是必然的发展趋势。5. 2 胶体金在快速斑点渗滤技术中的应用 ELISA法在临床实验室已得到普遍的应用,特别是用于各型肝炎标志物的检测。但ELISA法由于操作程序复杂,时间较长,需要洗板机、酶标检测仪等贵重仪器。给实验室带来不便。ELISA法需时较长的主要原因,是由于液相中的抗原(或抗体)需经扩散才能与固相上的抗原或抗体反应,不适当地缩短反应时间,将使灵敏度降至临床要求以下。为满足临床快速检测的需要,近年来发展了多种简便、快速的免疫学检测方法,快速斑点渗滤法即为其中一种,其标记物质用胶体金即称为快速斑点免疫金渗滤法(Dot-im2munogoldfiltrationassay),又称滴金免疫法。快速斑点渗滤法的基本原理仍是间接法或夹心法。间接法测抗体:固定于膜上的特异性抗原+标本中的相应抗体+金标记的抗体或SPA显色(将某一检疫传染病标准抗原固定于NC膜上制成检测试纸,取一滴待检样品滴加到膜上,再滴加金标记的抗抗体)。夹心法测抗原:固定于膜上的多克隆抗体+标本中待测抗原+金标记的特异性单克隆抗体显色(制备某一检疫传染病的多克隆抗体,固定于NC膜上制成检测试纸,取一滴待检样品滴加到膜上,再滴加金标记的单克隆抗体)。可根据需要设置不同的检测阅读模式,比如双点模式,如图2。也可以设计成加减号模式。如图3。若需要同时检测多个项目,也可以设计成多项目检测模式。如图4所示的双项目模式。


快速斑点免疫金渗滤法检测速度快,结果观察一目了然,已应用于多种临床检测项目。在大宗动物的出入境检疫和疾病普查中尤其能体现其优越性,不用荧光扫描仪等昂贵的设备,不需复杂的操作,不受实验条件的限制,在操作完成后即可直接观察结果,大大缩短检测时间和劳动强度。实验结果表明,胶体金的敏感性可达到ELISA的水平。利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理,采用银显影剂增强金颗粒的可见性,更可大大提高测定灵敏度,检测下限可低至0.1ng。胶体金免疫印迹技术如此简便、快速,且有相当高的灵敏度,在检验检疫上必有很大的应用潜力。