盐酸克伦特罗时间分辨荧光免疫检测方法的建立

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盐酸克伦特罗(Clenbuterol,CLB)俗名“瘦肉精”,化学名为“2-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3,5-二氯苯甲醇盐酸盐”,是一种β-2-肾上腺素能激动剂,在畜禽生产中曾被用作“营养重分配剂”及“促生长剂”。近年来动物性产品中CLB残留对人类健康和生态食物链造成的破坏已经引起世界各国的高度重视。从1986年开始,欧美等国家已严禁在畜牧生产中应用CLB;我国农业部于1997年3月以[农牧发(1997)3号文]严令禁止β-肾上腺素能激动剂在动物生产中应用,因此,建立准确、快速、高灵敏度的检测CLB的方法十分必要。

目前,检测CLB残留的方法主要有[1]:高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱法(CG-MS)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、毛细管区带电泳法(CE)以及免疫分析方法(IA)。仪器检测法存在样品前处理烦琐、检测时间长、需要贵重仪器等缺点。IA法检测特异性好、灵敏度高。目前用于检测CLB的免疫分析技术主要有放射免疫分析技术(RIA)、胶体金免疫分析(ICG)、酶免疫分析(EIA)、免疫亲和色谱法(IAC)以及生物传感器检测法(BS)[2]。时间分辨免疫荧光检测法(Time-resolvedfluoroim-munoassay,TRFIA)用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物,代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质,标记抗原、抗体、核酸探针等物质。当免疫反应发生后,根据荧光强度和相对荧光强度比值,判断反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的[3]。该方法具有测量灵敏度高、操作简便、示踪物稳定、定量分析量程宽、无放射性污染和应用范围广等优点,因此越来越多地应用于疾病诊断、疗效观察等医学研究领域[4],但在农兽药残留监控方面的应用甚少。因此,采用Eu3+标记的抗CLB单克隆抗体,开展了CLB时间分辨荧光免疫分析方法的研究。

1材料与方法1.1材料与仪器

1.1.1材料

盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺含量均大于99%,华南农业大学动物科学院提供;CLB-卵血清蛋白偶合物、抗CLB单克隆抗体,本实验室自制;96孔微量反应板,雷博公司产品;纯化离心柱(30kD),美国Minipore公司产品;阴性猪尿样,广州市兽药监督所提供;其它试剂均为国产分析纯。

1.1.2仪器

恒温振荡器,上海智城分析仪器制造有限公司;1-13型快速离心机,Sigma公司;1575型洗板机,Bio-RAD公司;微量可调移液枪,吉尔森公司;微量振荡器,江苏康健医疗用品有限公司;1235型TRFIA全自动分析仪,Wallac公司。

1.2方法

1.2.1CLB标准液的配制

CLB以标准品稀释液配制成质量浓度为20μg/mL的溶液,稀释到500ng/mL作为贮备液,使用前配成质量浓度梯度为0、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0ng/mL的CLB标准品工作液。

1.2.2CLB抗体的纯化及标记

将0.5mg抗CLB单克隆抗体加入到纯化离心柱中,8000r/min离心5~6min,加入200μL标记缓冲液,离心、弃滤液,再加入200μL标记缓冲液,按上述方法离心重复5次。将离心后的离心管取出,弃滤液,再将离心柱反转,2000~3000r/min离心1min,收集滤液,即为待标记抗体。铕标记抗体的方法参照文献[5]。

1.2.3最佳包被浓度的选择

将CLB-OVA以包被缓冲液分别稀释为0.2、0.5、2.0和5.0μg/mL,每个浓度作一横列,每孔加200μL,室温振荡1h后置于4冰箱过夜,次日室温平衡后洗板1次,以小牛血清封闭液室温封闭1h,洗板3次,于无尘吸水纸上拍干,不同浓度的包被板分别加入CLB系列标准品50μL,然后加Eu-Ab(11000倍稀释)200μL,每孔作一重复,室温振荡1.5h,洗板6次拍干,加增强液200μL,振荡5min,测荧光值,作曲线,确定最佳包被浓度。

1.2.4最佳铕标抗体稀释度的选择

铕标抗体分别稀释200、1000、5000、10000倍,以最佳包被浓度板加入系列浓度标准品,再加入不同稀释度的铕标抗体200μL,室温孵育1.5h,以下操作同1.2.3,确定最佳铕标抗体稀释度。

1.2.5最佳反应时间的选择

在包被好的板条中,加入系列浓度标准品50μL以及最佳稀释度的铕标抗体溶液200μL,室温分别孵育0.5、1.0、1.5、2.0h,以下操作同1.2.3,确定最佳反应时间。

1.2.6单抗稀释液的选择

分别以Tris-HCl(pH7.2、0.01mol/L)、PBS(pH6.0、0.01mol/L)、PBS(pH7.0、0.01mol/L)、PBS(pH8.0、0.01mol/L)4种缓冲液将铕标抗体稀释相同的倍数,室温孵育1.0h,以下操作同1.2.3,确定最佳稀释液。

1.2.7最佳反应体系的选择

在包被好的板条中,分别加入标准品50μL和铕标记抗体100μL,即150μL反应体系(体系);标准品100μL和铕标抗体100μL,即200μL反应体系(体系);加入标准品50μL和铕标记抗体200μL,即250μL反应体系(体系),室温孵育1.0h,洗板拍干后,根据各反应体系的最终反应体积分别加入增强液150μL和200μL,振荡5min后测荧光值,作曲线,确定最佳反应体系。

1.2.8TRFIA标准曲线的建立及样品测定采用最佳条件操作,在1235型TRFIA全自动分析仪上测荧光值,得到标准曲线。同时,作CLB为零浓度的孔12个,以零剂量点计数率(cps)均值减2s后的计数率在标准曲线上得到的相应浓度值为检测的灵敏度[6]。将高、中、低3个已知浓度的CLB标准品溶液添加到阴性尿样中,检测后计算添加回收率,各测3次,计算平均值。计算公式为:加标回收率(%)=(分析样品测得量-阴性样品测得量)/加标量×100%。以系列浓度的CLB及沙丁胺醇、莱克多巴胺两种近似抗原分别作竞争抑制曲线,计算各自的结合率,求出各自在IC50时的浓度,计算交叉反应率,即:交叉反应率=IC50时抗原浓度/IC50时近似抗原物质的浓度。方法的精密度以批内误差和批间误差来表示。

2结果2.1最佳包被浓度的确定

不同包被浓度得到的TRFIA曲线如图1所示。包被浓度越低,曲线的灵敏度越高,但荧光值过低(荧光值略)。综合考虑灵敏度与荧光值两方面因素后,选择包被质量浓度为0.5μg/mL。

2.2最佳铕标稀释度的确定

抗体稀释到5000或10000倍时,抑制效果较好,且两者相近,如图2所示。但稀释10000倍的铕标抗体使荧光值过低(荧光值略),故选择铕标抗体稀释5000倍为工作浓度。

2.3最佳反应时间的确定

不同反应时间所得到的抑制率如表1所示。虽然室温孵育0.5h与孵育1.0h计算得到的抑制率相差不大,但孵育1.0h后荧光值趋于稳定(荧光值略),说明反应充分,故选择反应时间为1.0h。

2.4单抗稀释液的确定

抗原抗体反应对pH值较为敏感,实验结果如图3所示。pH中性条件下反应充分,IC50较理想。本实验选择pH7.0(0.01mol/L)的PBS作抗体稀释液。

2.5最佳反应体系的确定

结果见图4,体系与体系抑制效果相差不大,但体系各点荧光值较低(荧光值略),主要是因为CLB标准液的增加使游离CLB与铕标抗体结合的机会增加,因而结合在固相抗原上的铕标抗体减少,荧光值相应就会降低。故选用体系为最佳反应体系。

2.6TRFIA标准曲线的考核

实验过程中发现,标准品的质量浓度调整为0、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0ng/mL,曲线的线性好,故标准曲线采用以上各浓度点。最佳条件下,在Wallac1235型TRFIA全自动分析仪上得到TR-FIA法测定CLB的标准曲线,如图5所示。

2.6.1灵敏度间接竞争

TRFIA测CLB方法的灵敏度为0.03ng/mL,曲线的相关系数达0.99以上,说明方法的线性关系较好。

2.6.2精密度和特异性

TRFIA检测CLB方法在0~10ng/mL质量浓度之间的批内和批间变异系数分别为2.0%和8.9%,与沙丁胺醇、莱克多巴胺交叉反应率分别为0.96%和0.77%,说明方法精密度良好,特异性强。

2.6.3加标回收率

由标准曲线测得的结果,计算得到方法的平均加标回收率为105.8%,如表2所示。

3.讨论

采用TRFIA技术进行CLB检测的方法尚未见报道。国内采用气质联用(GC-MS)方法作为CLB的确证方法,此法最低检测限为1.0ng/mL;毛细管区带电泳法(CE)以及放射免疫分析技术(RIA)最低检测限为0.5ng/mL[7];SawyaWN.、Degand等[8]建立的直接竞争ELISA检测CLB残留量,最低检测限为0.05ng/g;本研究建立的TR-FIA方法灵敏度为0.03ng/mL,且反应时间仅需1h,操作步骤简便。TRFIA是以荧光读数为分析基础,零剂量CLB的荧光值越高,灵敏度提高的可能性就越大。由于采用以铕直接标记抗CLB抗体,要提高荧光值就必须提高铕标CLB抗体的量,而对于固相抗原和游离抗原竞争抗体上的结合位点来说,抗体量的增加有可能减弱这种竞争力,对方法的灵敏度产生不利影响,所以如何在保持高灵敏度的条件下提高荧光值,还需要从铕标记效率的提高以及增强液的质量或竞争分析模式方面作进一步的研究。

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