HCG时间分辨荧光分析方法的建立

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人绒毛促线性激素是胎盘绒毛组织和体滋养层细胞合成分泌的一种糖蛋白,由∝和β亚基组成。由于木孕妇女血清或尿样品中检测不到hCG蛋白,而孕早期妇女的血清或尿样品中却能检测到hCG蛋白,因此hCG蛋白(尤其β-CG)的定量检测技术可用于临床确定早期妊娠、流产危险性的预测叫、异位妊娠和滋养细胞疾病的临床诊断以及对其治疗效果的监测。此外,高水平的hCG还可能与胎儿异常、新生儿呼吸窘迫综合征、新生儿黃疸及死胎的发生有关凹。我们采用时间分辩荧光测量技术,以稀土离子为示踪材料,建立了母血清β-hCG的全自动时间分辨荧光免疫分析法(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFA),该方法具有測量灵敏度高、操作简便、示踪物稳定、定量分析量程宽、无放射性污染等优点,可用于对整个妊娠过程的临床诊断、治疗和预后评判,包括在围生医学领域,有望成为预测妊娠不良结局的临床常用技术指标。
1材料和方法1.1材料与试剂1.1.1材料
抗βCG单克隆抗体,50例孕如(22-36岁)血清标本(华山医院放射科提供)。
1.1.2试剂
Eu标记盒(124-302)(EG&G-Wallac,乙烯三胺五乙酸(DTPA)(Sigma),PD10和SepharoseCL-6B(Pharmacia),牛血清白蛋白(BSA)、牛lgG(上海生物制品所产品,增强液(江苏省原子医学研究所配制,去离子水,全自动TRFIA检测仪(Autodelfia1235)为EG&G-Wallacr"品
1.2固相抗体制备BhCG单抗用50mmol/L NacONaHco3的缓冲液pH6稀释成10mgL的包被液96孔微孔板每孔加200μ,4放置过夜。弃包被液,冲洗3次,加200含3g/LBSA的上述缓冲液封谢,4放置过夜。弃封闭液,真空抽干,Eu+hCG单克隆抗体制备及活性鉴定参照Eu标记盒说明书操作,取1mgB-hCG单抗t(Clone:827)经PD-10柱转换缓冲条件洗脱液为含0155mNaC的50mmol/LNaCO-NaHCO缓冲液pH85。收集蛋白峰,经紫外吸收分析定量(146Ax074A3),浓缩至2g/L。取200山加入含02mg的Eu”Np异氰酸-苄基]--乙烯三跋四乙酸(Eu-DTTA)冻干粉的小瓶中,30磁力搅拌反应20h后,再经用80mmol/LTris-HCl缓冲液pH78平衡的SepharoseCL6B柱(1×40cm)层析,A∞8监测收集蛋白峰,稀释后分装冻干保存。取制备成功的Er-hCG,通过SepheradexG50层析后,收集第一洗脱峰,测量该洗脱峰的Eu”含量,鉴定其理化活性
1.4测定方法以含8mmol/LNaC1、0.1%BSA、0.2%牛IgG50μmoL/LDTPA、0.1mI/Tween80和0.1%NaN3的50mmol/LTris-HCI为反应缓冲液pH78;以含14.5mmol/LNaCI、0.2mULTween-80和0.2%NaN3的Tris缓冲液为洗涤液。采用平衡夹心法建立βhCG-TRFIA:即在包被有β-hCG单抗(Clone:812的96孔微孔板上,每孔依次加入25BhCG参考标准或待测血清,200μ反应缓冲液。25振荡孵育1h后,用洗涤液洗涤2次,再加200μ以反应缓冲液1:50稀释的Eu3-p-hCG单抗(Clone:827")25振荡孵育Ih后,用洗涤液洗涤6次。再加增强液200山25振荡反应5min,荧光检测。全部过程均在AutoDelFia1235上自动完成。

1.5数据分析

AutoDELFIA1235自带的Logit-Log函数处理。
1.6与BeckmanAcess分析结果比较CGKit按Beckmanacess全自动微粒子化学发光免疫分析系统说明书测量血清β-hCG含量
2结果2.1Eu"·β-hCG的理化和免疫学鉴定Eβ-hCG经SephadexG-50层析后,收集第一洗脱峰。以EG&GWalla提供的Eu标准为参考,第一洗脱峰的Eu含量为27μmolL,827单抗的含量为32molL,即每个阝CG单抗分子上连了84个Eu”。BhCG的参考标准高点(700UML)684与低点(2U)的发光计数差在3个数量级以上。表明Eu2“-BCG的定量分辨率好,被测物的量和发光计数基本成算术级数正比关系。
2.2Eu3TRFIA的考核经Logit-Log函数数据处理程序处理后所得的EutRFIA标准曲线见图1。
2.2.1特异性
即交叉试验。将AFP配成20010000μg/L一系列不同的浓度,代替标准曲线中的βhCG参考标准,在上述浓度范围内,AFP结果阴性,无交叉反应;同时LH的质控结果也为阴性。2.2.2准确度即回收率试验。取第23号血清样品(-hCG测定值x=2838UL),分别加入不同的βhCG参考标准[高点(7000TU)到低点(2L)中,作回收率试验,测得值与期望值十分接近,平均回收率为96.5%。22.3健全性即平行性试验需有具体数据.取高浓度的第10号正常人血清样品(β-hCG测定值x=19622IU/L)作1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320倍比稀释后,对此7个不同浓度的点进行TRFIA评价,结果分别为=19622IUL,3540IU/L2140IU/L,1190IU539IU/L,215IUL,134IU/L。显示理论值与实测值的回归曲线的线性关系佳,与Eu3-B-hCGTRFIA标准曲线平行,成正比关系,提示TRFIA法有效性好

2.3与BeckmanAcess比较
50例人血清样本分别用TRFIA和CLIA(BeckmanAcess全白动微粒子化学发光免疫分析系统)测定其中β-hCG的含量,两种方法测得结釆间呈高度相关,在两者共同可测范围内的样品的相关系数为0972,见图2。

成对数据平均数比较法作1检验,两者测得结果间无显著差异(P>0.05)。
3. 讨论时间分辨荧光免疫分析法之所以能够继放免酶标、化学发光、电化学发光后成为一种更新、更灵敏的检测方法,主要取决于它所用标记物的独无二的物理及化学性质。TRFIA是用系元素的三价金属离子及其鳌合物作为示踪物,如铕Eu3)、钺(Te)及钐(Sm)、锎(De)等来代替传统的荧光物质、同位素、酶和化学发光物质,标记抗原、抗体、核酸探针等物质,使其兔疫测量灵敏度达到10-°moL。而其他标记免疫法测量灵敏度分别为:酶联免疫(EIA)10°molL,放射免疫RIA)10molL,化学发光(CLA10"mo,电化学发光ECLA)108molL。目前,该技术在国外已被广泛用于多种血清指标的临床检测“;并且其新的应用也不断被开发出来,如免疫组织化学、微阵列、PCR等;还可用于双标记明、三标记和四标记等多标记物的免疫分析本实验跟踪国际上最新发展的临床诊断技术采用非放射性原子标记方法,结合免疫反应,从微量样品的分析需求出发,我们用固相双位点抗体夹心两步法,碱少样品对分析系统的干扰,建立起hCG-TRFIA检测新技术,并对其进行了多项指标的考核,作了统计学分析。实验表明,时间分辩荧光免疫分析具有零本底,特异性强,标记物存放时间长,可重复多次检测,重复性好,标准曲线稳定性高,分析时间短(仅2h),实现全自动化操作等优点;在敏度和动态测量范围上,与CLA方法相近,分别比RIA高出1-2个数量级。准确度,平均问收率为965%,在土5%以内,回收试验、健全性试验令人满意。我们建立的βhCG-TRFA分析系统不仅可以用于科研,而且由于其高度自动化,能有效提高临床大样本量检验结果的速度,大幅度降低人为误差,增加检出结果的可靠性,对整个妊娠过程的临床诊断、治疗和预后评判起到更好的指导作用,是种具有极高应用前景的超微量定量检测方法。
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