免疫胶体金技术

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胶体金技术即免疫金标记技术，它以胶体金为标记物，利用特异性抗原抗体反应，通过带颜色的胶体金颗粒来放大免疫反应系统，使反应结果在固相载体上直接显示出来，从而达到用于检测待测样品中的抗原或抗体的目的。该技术作为一种新的检测方法，具有敏感性高、特异性强、稳定性好等优点。其在医学、动植物检测等各研究领域发展迅速。本文综述了胶体金技术的基本原理、制备方法、胶体金快速检测特点以及在兽医学上的应用研究进展，并分析了该技术存在的问题及发展趋势。
1 胶体金技术及其基本原理胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精确。因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。
胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作_}}j下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作成为一种稳定的胶体状态。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子非共价结合，如葡萄球菌蛋白A、植物凝集素(PHA)、刀豆素A。(ConA)、免疫球蛋白、抗生素等。胶体金标记技术实质上就是蛋白质分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。因而在基础研究和检验检疫中成为非常有用的工具。免疫胶体金颗粒具有高电子高密度的特性，在显微镜下金标蛋白结合处，可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，而可用于定性或半定量的快速免疫检测。
2 胶体 金的制备2．1肢体金的制备方法制备胶体金溶液最常用的方法是化学还原法，基本原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可制备出不同大小的胶体金颗粒。常用的制备方法有白磷还原法、抗坏血酸还原法、柠檬酸三钠还原法、鞣酸～柠檬酸钠还原法、乙醇超声波还原法和硼氢化钠还原法等。其中最常用的制备方法为柠檬酸三钠还原法：将0．01％的氯金酸溶液加热至沸腾，快速搅拌的同时迅速加入1％的柠檬酸钠水溶液，继续加热，直到溶液颜色逐渐由浅黄色变为澄清透明的红色。此法制备程序简单，胶体金的颗粒形状、大小较均一。
2．2胶体金标记胶体金一蛋白复合物又称胶体金探针，用于免疫测定时多简称为免疫胶体金(immunogold)。胶体金标记蛋白的制备，实质上是蛋白质等生物大分子物质被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。标记前需将蛋白质用双蒸水透析以除去影响标记的电解质，然后通过系列稀释法找出能使胶体金稳定的蛋白质溶液的最低浓度，在此基础上再加1％～20％，即为最佳标记量。将待标记蛋白以最佳标记量适当稀释后，缓慢滴加到胶体金中，继续搅拌20min，然后缓慢滴加10％的BSA至终浓度为0．5％或1％(或加入10％PEG20000至终浓度为1％)，继续搅拌lh。4静置2～3h(或过夜)，终止反应。反应结束后，4lO000r／min离心1h，弃上清液。将沉淀悬浮于1／10原体积的1％BSA中，离心洗涤，加入等体积的1％BSA溶液，最后加人含0．02％叠氮钠防腐剂的TBS缓冲液悬浮，即可获得胶体金探针，也可加甘油混匀，4保存备用。标记好的免疫胶体金溶液可4保存数月。
3 胶体金快速检测技术免疫胶体金快速检测技术主要包括快速斑点免疫金渗滤法(DIGFA)和胶体金快速免疫层析法(CGEIA)，其基本原理均是以微孔膜为固相载体，包被已知抗原或抗体，加入待测样本后，经微孔膜的渗滤作用或毛细管虹吸作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金标记物与之反应形成红色的可见结果而达到检测目的。
3．1快速斑点免疲金渗滤法(DIGFA)又叫滴金免疫渗滤试验(Dot—immunogoldfiltrationassay，DIFA)，由SpielbergF等于1989年建立，为穿流形式(Flowthrough)。该实验以微孑L膜为固相载体，其上固定有已知特异性抗原或抗体，将其装入充满吸水材料的渗滤装置中，加入待检标本后，经滤膜的毛细管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上包被的抗体或抗原结合，再用胶体金结合物标记而达到检测目的。反应可根据待测物的不同，选择不同试验方法，特别适合于问接法检测抗体或捕获法检测IgM。一般需要3～5步，但所需时间很短，只需3～6min。
3．2胶体金快速免疫层析法(CGEIA)该试验是在免疫渗滤试验的基础上建立的一种简易快速的检测技术，由BeggsM等“最先用于人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgo—nad0thphin，HCG)的测定，为侧向横流形式(Lateralflow)。该技术也是以微孔膜为固相载体，其原理是将已知的特异性抗原(或抗体)固定于膜上作为检测带，胶体金标记物十燥在玻璃纤维的结合释放垫上，其一端与膜相连，另一端与样品垫相连，膜的另一端连有吸水垫。当加人待测样品(全血、血清、尿或其他体液)后，样品通过毛细管的扩散作用向前移动，并通过含标记物的玻璃纤维，使标记物重新水化，并与胶体金标记物相互反应，然后一起向前泳动，至检测线(固定有特异性抗原或抗体)时标记物与待测物的复合物会被检测线截获，而出现明显而直观的红色结果。如果样品中不含待测物，则会和游离标记物一起越过检测线，到达质控线或试验终止线，被截获而出现红色的对照结果。多采用夹心法检测抗原或问接法检测抗体，也有采用双孔间接法或反流免疫层析法检测IgG和IgM，对于小分子抗原(如药物残留、类固醇的测定等)来说则宜采用竞争抑制法。
4胶体金快速检测技术的特点4．1检测面广免疫胶体金技术既可用于抗原抗体检测，也可用于体内生物活性物质、激素、半抗原等小分子物质的检测。可广泛应用于动物疫病快速诊断和兽药残留快速检测等领域。
4．2操作方便不论是胶体金免疫层析技术还是斑点免疫金渗滤技术都具有操作步骤简单无需特殊仪器、样本无需特殊处理、检测结果可直接用肉眼判读等特点，操作方便，对操作人员无特殊技能要求。
4．3快捷迅速免疫胶体金快速诊断技术需时短，一般只要5～10min就会出结果。而其它方法如ELISA需要1～2h，PCR需要时间更长。
4．4特异性强由于该技术大多用单克隆抗体标记，这决定了它只对某一抗原决定簇进行检测，因而具有很好的特异性。
4．5灵敏准确由于试验条件的不断优化，许多试验的灵敏度都可达到lng／mL或更低水平。该技术与ELISA的平行检测中总体符合率均在95％以上，显示该技术结果准确可靠。
4．6携带方便由于胶体金标记蛋白质是一物理结合过程，结合牢固，很少引起蛋白质活性改变，所以试剂非常稳定，不受温度等外界因素影响，可随身携带，随时检测，检测结果也可长期保存。
4．7安全环保与其它检测方法相比，免疫胶体金技术大大简化了操作，没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与试验，所以既不会损害操作者健康，也不会污染环境，具有放射性同位素或酶标等检测方法所无法比拟的安全性。
5胶体金技术在兽医学中的应用5．1在畜禽病毒病诊断中的应用 随着养殖业规模的不断 扩 大和畜禽疫病 的复杂化 ，对疫病的诊断及鉴别诊 断要 求不 但要准确 ，而且要求快速 ，才 能有效 的做好 防治工作 。伴 随着病毒抗原检测技术的进步，免疫胶体金技术以其快速、简便、 可单份 检测 、灵敏度 高 、特异 性强 、稳定 性好 、检测 标本种类多等优点也开始被逐渐应用于畜禽病毒病的诊断。
目前 ，利用胶体金技术制备 的试纸在畜禽病毒病 的诊断中发挥 了重要的作用。郑鸣等用胶体金标记抗原和双抗原夹 心法建立的猪瘟病毒抗体检测免疫层析试纸条，它可以用来猪瘟的临床诊断，这种检测方法操作简单、灵敏度高、特异性 好，并且能区分强弱毒感染；孔繁德等应用提纯的蓝耳病病 毒抗原包被硝酸纤维素膜，用胶体金标记金黄色葡萄球菌 A 蛋向(SPA)建立了检测PRRSV抗体的斑点免疫金渗滤法。 该种方法 与 ELISA方法 的符合率达98％。
此外 ，如鸡新城疫、减蛋综合征、传染性法氏囊病 、传染性支气管炎 、雏鹅新型病毒性肠炎 、犬瘟热、狂犬病 、乙型肝炎等多种疫病 的胶体金诊断试纸条也相继研制 出来，给疾病 的监测和预 防提供了良好的信息手段 。
5．2在言禽病细菌病诊断中的应用胶体金技术在畜禽细菌性疾病的诊断中作用也十分突出。张书环等用大肠杆菌表达的牛分枝杆菌重组抗原MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原，制备的牛结核抗体检测试纸条，具有较高的特异性，应用该试纸条做交叉试验时，牛的其他非相关疾病的阳性血清呈阴性反应；唐景峰等建立诊断布病的胶体金免疫层析方法体金标记单抗，以多克隆抗体作为检测线检测布病，该种方法与PCR检测符合率为100％；刁琳琪等用双抗体央心法的原理，以胶体金标记一株单抗制备的试纸条可快速筛选标本巾的大肠杆菌O157。近年来，更多的细菌性疾病，如鸡自痢、霍乱等诊断试纸条也研制出来，有的已在基层兽医中普及应用。
5．3在寄生虫病诊断中的应用大多数寄生虫病是人兽共患性疾病，因此，对畜禽寄生虫病的诊断具有很重要的公共卫生学意义。李学伍等利用旋毛虫重组分泌抗原研制的旋毛虫病快速金标试纸条具有良好的特异性和敏感性，且与ELISA和消化法检测结果的符合率为100％。何伟等建立的检测血吸虫抗体的胶体金试纸条诊断方法敏感性高，特异性较强，阳性检出率为100％，阴性符合率分别为94％～95_3％。疟疾是严重危害人类健康的虫媒传染病，病原为疟原虫。研制简便快速、敏感价廉适于基层应用的诊断试剂盒，是疟疾防治中迫切需要解决的课题。近年来以单抗为基础的免疫层析试验ICT，对疟疾诊断的灵敏度能达到100％、特异性99．74％，展示了其广阔的应用前景。
此外，一些其他的寄生虫，如日本血吸虫病、边虫病、片形吸虫病、奶牛肝片吸虫病、羊东毕吸虫病、绵羊脑多头蚴、棘球蚴囊肿等疾病抗体的检测，尤其是原虫病的胶体金检测试纸条正在研制中，有的也已在进行临床试验。
5．4在兽药残留中的应用兽药残留是危害人类身体健康和影响畜产品质量的因素之一，目前国际上通用的检测方法是初筛加确证的方法，即首先采用一种简便的方法对待检样品进行快速初筛，而后采用准确性较高的方法对初筛结果为阳性的样品再进行确证分析。利用胶体金试纸条检测是常用的初筛方法。李余动等用胶体金标记氯霉素单抗，利用竞争式的方法让人工合成的氯霉素与待测样品中氯霉素竞争结合金标氯霉素单抗，检测虾肉等组织样品时，最低检出量可达到lng／mL。刘见将盐酸克伦特罗通过一定方法免疫动物后获得高效价的特异性抗体，用胶体金标记抗体后制备成试纸条。试纸条对盐酸克伦特罗的最小检测量为40ng／mL，检测86份ELISA试剂盒测定阴性样品和42份阳性样品，其符合率分别为100％和95．2％。目前针对四环素等多种抗生素和药物的胶体金试纸条也正在研制过程中，不同的报道相继不断，试纸条的特异性和灵敏性也正在向更高方向发展，胶体金技术在药残中的作用也日益突出。
5．5在重金属以及毒素中毒检测中的应用重金属是有毒的、持久的环境污染物，在农畜等产品中都有不同程度的残留。随着工业化进程的加快，重金属通过食物链的生物放大作用进入人体，在人体内长期积累，对人类健康构成严重威胁。免疫胶体金检测技术具有检测速度快、费用低廉、简单易携、灵敏度高和选择性强等优点，可用于现场检验。在对农畜产品的现场抽查及进出口快速通关检测中，利用胶体金试纸条对产品中的重金属离子含量进行初测，根据试纸条上面的颜色深浅程度判断重金属离子含量是否超标，若超标或者是接近超标，则可选择化学方法精确测定重金属离子含量。利用免疫胶体金快速诊断来初测农畜产品中的重金属离子含量，可以节省时间，大大加快检测进程，提高现场抽查和快速通关检测的效率。目前，国内外已经建立了针对有机污染物的免疫胶体金检测方法，并且将该方法用于重金属离子的分析检测，迄今为止，免疫胶体金检测技术已经成功用于水中的铟、汞、镉、铅和铀等的检测。
在毒素检测方面，胶体金试纸条也显示出它的优势。适合于现场的快速检测，高灵敏度的胶体金试纸条已研制成功，有的甚至是ELISA检测方法敏感度的两倍。Shyu等人研制了检测蓖麻毒素的胶体金试纸条，试纸条灵敏性和特异性均可比得上ELISA的方法。Timo、左庭婷等利用胶体金标记技术，分别研制了检测A、B、D、E型肉毒毒素的试纸条，试验的敏感性甚至达到50pg／mL。
6胶体金免疫技术存在的问题及展望
免疫胶体金技术自诞生以来便以其简便快速、特异敏感等优点被广泛应用于快速检测和现场诊断上，显示出巨大的发展潜力和广阔的应用前景。但是其在实际研究及应用过程中仍存在一些不足之处：首先，该方法在检测过程中常出现假阳性和假阴性问题。其次，检测的灵敏度及可重复性程度不高，检测范围需要进一步扩展。最后，因免疫胶体金技术是以胶体金纳米颗粒作为标记物，颗粒本身的一些特性也导至免疫胶体金技术的应用受到一定限制，如在操作过程中要求清洁程度高，胶体金溶液的稳定性较差，存放时间短，胶体金颗粒大，渗透能力较差等。.
进一步提高金标快速试验的敏感性、特异性、实现多元检测、实现定量或半定量检测是未来金标免疫快速试验发展的方向，具体包括以下几个方面：(1)提高胶体金质量。进一步完善免疫胶体金的制备工艺，使之标准化、程序化，以利于提高检测准确性和可重复性，从而减少假阴性(假阳性)结果的产生。(2)进一步提高检测灵敏度，拓宽检测范围。采用新的标记物或引入生物素一亲和素系统(BAS)以及基于金、金银染色的彩色染色法均可通过对捕获信号的放大从而达到提高灵敏性的目的。(3)实现检测多元化。可采用多膜复合或单膜多元受体固定两种方式，一次检测可同时得到一组结果，节省检测时间及成本，这对于检测某些具有联检意义的物质具有很大的应用价值。(4)实现定量测定。目前，免疫胶体金技术定量检测有3种类型：第1种是通过试纸条的颜色深浅的视觉比较将结果分为阴性、弱阳性、中阳性和强阳性；第2种是将检测线的反应剂设计成只能结合已知一定量的分析物，任何过量的分析物将会和下一条检测线结合，产生一个温度计式的条带梯度；第3种是应用反射的光密度计测量显色带或斑点的颜色强度，将颜色强度转化为数字指标。前两种检测方法虽简便迅速，但只能提供半定量结果，第三种检测方法虽能实现定量检测，但需特殊的仪器，操作不便。新的、简便实用的定量检测技术的实现将使免疫胶体金技术在兽医快速检测上得到更为广泛的应用。