免疫胶体金技术的应用及展望

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免疫胶体金技术((Immunecolloidalgoldtech2nique,ICG))是一种常见的标记技术,它是以胶体金为标记物,利用特异性抗原抗体反应,在光镜电镜下对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术,是继三大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展起来的固相标记免疫测定技术。胶体金最早由法拉第发现于1857年,他用还原法从氯金酸水溶液中制备胶体金,并发现在其中加入少量电解质后,可使胶体金由红色变为蓝色,最终凝集成无色,而加入明胶或其他大分子物质便可阻止这种变化,他的重大发现奠定了胶体金制备和应用的科学基础。1971年Faulk和Taylon[1]首次用兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合、制备成金标抗体检测细菌表面抗原的分布。1974年,Romano等[2]用胶体金标记抗球蛋白抗体,建立间接免疫金染色法。此后,胶体金作为一种新型免疫标记技术得到很快发展。1980年,Geoghegan[3]应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原,建立了光镜水平的免疫金技术(immunogoldstaining,IGS)。Danscher[4]在此基础上改进并发展了用银显影液增强光镜金颗粒可见性的免疫金染色法(im2munogoldstaining,IGSS)。Holgate[5]又对上法加以改进,将免疫金染色与银显影技术相结合,建立免疫金银染色法(immunogoldsilverstaining,IGSS)。近年来,研究人员根据胶体金的物化性质进一步拓展了基于胶体金标记的生物检测技术及胶体金在其他生物学方面的应用。目前已广泛应用于被动凝集试验、光镜染色、免疫印迹、流式细胞术、液相免疫测定、斑点金免疫渗滤及免疫层析等,其中在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immuno2chromato2graphicassay,ICA)和快速免疫金渗滤法(Dot2immu2nogoldfiltrationassay,DIGFA)。免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法,因其快速简便、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点已在人医的临床检验和其它领域取得广泛的应用,如妊娠试验、传染病病原抗体的检测、蛋白质的检测和药物测定等,该技术在兽医临床上的应用也日益广泛。

1胶体金技术的基本原理

氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,形成带负电的疏水胶溶液,由于静电作用而成为稳定的胶体体系,故称胶体金。胶体金颗粒散在,直径从几纳米到几十纳米不等,由于不同直径的胶体金的光散射各异,所以其溶胶颜色的深浅相应发生显著的变化,这就是胶体金用于被动凝集试验的基础。胶体金标记实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程,吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷,与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒,这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素和激素等多种物质非共价结合,从而使其成为免疫反应的优良标记物。免疫胶体金颗粒具有高电子高密度的特性,在显微镜下金标蛋白结合处,可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而可用于定性或半定量的快速免疫检测,而且金颗粒还可催化银离子还原成金属银,因此在胶体金免疫测定时加入银染色液,能放大反应信号,大大增加测定的灵敏度。

2胶体金的制备及胶体金的标记2.1胶体金的制备

胶体金的制备一般采用还原法,常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。其原理是利用还原剂将氯金酸溶液中的金离子还原成金原子,根据还原剂类型以及还原作用的强弱,可以制备5-150nm不等的胶体金,一般还原剂用量越大制备的胶体金颗粒越小。最常用的制备方法为柠檬酸钠还原法,操作过程如下:取100mL0.01%的氯金酸(HAuCl4)水溶液用水浴磁力搅拌锅加热至沸腾,在磁力搅拌器以一定转速不断搅拌下迅速加入所需用量的1%柠檬酸三钠水溶液,继续搅拌加热约15min至溶液颜色稳定不变。胶体金制备过程要求所用玻璃容器必须绝对清洁,玻璃表面少量的污染会干扰胶体金颗粒的生成,产生凝集颗粒,因此玻璃器皿用前要经过泡酸、超声洗涤处理,并用蒸馏水、超纯水依次冲洗浸泡,然后烘干备用。

2.2胶体金的标记

由于胶体金颗粒在电解质中不稳定,制备后应立即用大分子(如蛋白质)进行标记。胶体金颗粒对蛋白质的吸附作用取决于pH值。在pH值=pI值时,蛋白质溶解度最小,水化程度最小,最容易吸附到疏水的金颗粒表面,但在实际操作中,一般胶体金溶液的pH值调到稍高于标记用蛋白质的PI值,这样蛋白质带正电,结合更稳定,可用0.1mol/LK2CO3或0.1mol/LHCL调节胶体金溶液的pH至选定值,但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定,在调节胶体金的pH值时,胶体金会阻塞pH计的电极,因此可用普通PH试纸先调到目标pH值附近再换用精密pH试纸调节[6],也可以用胶体金专业pH计调节pH。标记应在磁力搅拌下,逐滴加入待标记蛋白溶液,混匀30min后继续在磁力搅拌下加入10%BSA,使其终浓度为0.5%,搅拌混匀15min,再加入5%PEG20000至终浓度为0.1%,再持续搅拌混匀15min,最后4静置过夜。由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附,并可使胶体金聚沉,因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度,应在标记前先对低离子强度的双蒸水透析去盐,并通过离心及微孔滤膜过滤以除去细小颗粒,然后通过系列稀释法找出能使胶体金稳定的待标记蛋白的最低浓度,这一浓度再加10%即为最佳标记蛋白量。标记好的胶体金还应加入终浓度为0.05%-011%的PEG6000或PEG20000作为稳定剂[7]。

多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂,PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用,一为保护胶体金的稳定性,使之便于长期保存;二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择十分重要,不适当的稳定剂有时也会导至非特异性反应。

2.3胶体金标记后的纯化

标记好的胶体金中往往还含有未结合的蛋白质、未充分标记的胶体金以及标记过程终形成的各种聚合物。因此标记好的胶体金还需经过纯化才能使用,一般纯化方法有离心法和凝胶过滤法等。采用离心法时,一般颗粒10nm以上的胶体金可高速离心,颗粒小于10nm的胶体金要用超速离心,在4离心15min至1h不等,弃上清,沉淀用原体积的0.02mol/LTBSpH8.2(含1%BSA,0.05%叠氮钠)溶解,重复离心2-3次,沉淀溶于原体积的1/10PBS溶液中,4保存备用。凝胶过滤法为纯化免疫胶体金的最好方法,过滤的胶体金颗粒比较均匀,不容易凝集,而离心法转速高,时间长,胶体金颗粒沉淀后容易凝集,用凝胶过滤法克服了这一弱点。将浓缩好的免疫胶体金先以1500r/min离心除去大的聚合物,取上清液过柱。可用Sephacryls2400或Sepharose24B(或6B)装柱,0.02mol/LTBSpH8.2平衡和洗脱。

3免疫胶体金技术的应用3.1免疫胶体金技术在电镜上的应用

20世纪人们将电镜技术与免疫学方法相结合,逐步形成了免疫电镜检查术。随着胶体金标记技术的发展,该技术逐渐被引入到免疫电镜技术中来。胶体金是用于免疫电镜的最佳标记物,因为它呈球形,非常致密,在电镜下具有强烈反差,容易追踪在电镜下检出抗原抗体复合物。胶体金免疫电镜技术已成为目前最常用的免疫细胞化学方法之一,它具有灵敏度高、特异性强、定位精确等优点,同时它还可以对抗原进行定性、定量、定位的分析与观察。应用免疫金双重或多重标记法,可将形态、功能和结构的研究融为一体,有助于了解同一组织或细胞内不同分子间的相互关系,以及它们的合成、分泌、转运等代谢过程。薛拥志等[8]通过直接电镜、免疫电镜、胶体金免疫电镜技术等3种不同电镜技术观察新城疫病毒,结果证明用胶体金免疫电镜技术观察时由于视野中病毒粒子周围有胶体金颗粒附着,金颗粒呈现强烈的反差,很容易找到病毒粒子,免疫金标记可以显著的提高样品的病毒检出率。刘霓红等[9]建立用免疫胶体金电镜检测技术检测犬细小病毒,证明免疫胶体金电镜技术有助于提高CPV检出率和特异性。

3.2免疫胶体金技术在生物传感器上的应用

近年来金标记被引入生物传感器中的应用研究增多。已有许多致力于信号放大免疫传感器的研制报道,其中应用较多的是通过阻抗信号的变化来检测抗原(抗体)的含量。Kim等[10]通过交流电导法检测了在叉指电极上的金标记的免疫凝集,从而实现了胶体金免疫层析试验的电化学检测方法,并且通过在胶体金上包被导电聚合物聚苯,提高电导法测定金标免疫反应的灵敏度。Brainina等[11]在标记胶体金标记A蛋白的基础上,制作了诊断森林脑炎的电化学免疫传感器,检测血清中的森林脑炎抗体及其浓度。Tang等[12]基于铂金电极修饰的胶体金提高了生物传感器检测HABS表面抗体敏感性和稳定性。Kitano等[13]用基于胶体金表面等离子共振效应的电感受器测定胃蛋白酶的亲和常数。

3.3免疫胶体金快速诊断技术

免疫胶体金快速诊断技术,由于方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观,并可保存试验结果等优点,已在医学、动植物检疫、食品安全监督各领域得到了日益广泛的应用。目前,医学检验中应用的免疫胶体金快速检测技术主要有快速斑点免疫金渗滤法(DIGFA)和胶体金免疫层析法(GICA)两种方法。这两种方法都是以微孔滤膜为载体,包被已知抗原或抗体,加入待检标本后,经滤膜的毛细管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上包被的抗体或抗原结合,再用胶体金标记物与之反应形成红色可见结果从而达到检测目的。

3.3.1斑点免疫金渗滤法斑点免疫渗滤技术是20世纪80年代中期从固相酶免疫测定技术发展起来的较简便的固相标记免疫测定方法,该技术主要应用微孔滤膜(NC膜)作载体的免疫检测技术,先将抗原或抗体点于NC膜上,封闭后加待测样品,洗涤后用胶体金探针检测相应的抗原或抗体。通过金颗粒来放大免疫反应系统,使反应结果在固相载体NC膜上显示出来。Moeremans等用此法研究表明免疫胶体金斑点渗滤法比间接过氧化物酶法更敏感一些。

曹三杰等[14]建立了斑点免疫金染色法检测PPV抗体的方法,对猪细小病毒病抗体最小检出量为1.008×10-10g/mL,并且不同猪布鲁氏菌病、猪伪狂犬病、猪衣原体病、猪口蹄疫、猪瘟及猪弓形体病等的阳性血清出现交叉反应。孔繁德等[15]通过用胶体金标记SPA建立检测猪瘟抗体水平的斑点免疫金渗滤法检测试纸盒与目前猪瘟的常规检测方法dot2ELISA法和间接血凝试验同时对200份猪血清进行猪瘟抗体检测比较,符合率达9814%和9819%,说明该法特异、灵敏。王祥等[16]建立了特异性地检测猪流行性乙型脑炎病毒抗体的斑点金免疫渗滤测定法,与血凝抑制试验(HI)对比检测了54份猪血清临床样本,两法的阳性符合率为7114%、阴性符合率为6515%、总符合率为8114%。孔繁德等[17]应用胶体金标记纯化的兔抗沙门氏菌抗体21,SPA包被硝酸纤维素膜作对照点,建立直接检测沙门菌的斑点免疫金渗滤法(DIGFA)检测试纸盒最低检测量为415×106CFU/mL,将该法与国标法检测效果比较,符合率达100%。朱明东等[18]对布鲁氏菌病监控地区重点人群和不同职业人群采用斑点金免疫渗滤法(DIGFA)和试管凝集试验(STA)检测布鲁氏菌病抗体结果表明重点人群两种方法检测抗体阳性符合率为96166%,阴性符合率为99192%;不同职业人群两种方法检测阳性符合率为96136%,阴性符合率为99192%。该法敏感性和特异性与ELISA法具有良好的相符性,且具有反应快、操作简便、结果易于观察等优点,标记好的诊断试剂盒可以长期保存,随时使用,更适合于基层推广应用。3.3.2胶体金免疫层析法胶体金免疫层析技术是20世纪90年代初在免疫渗滤技术的基础上建立的一种简易快速的检测技术,由Beggs等[19]最先用于人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadothphin,HCG)的测定。近年来该技术发展迅速,在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。

胶体金快速诊断试纸条主要是将特异性的抗原或抗体以条带状包被在NC膜的检测线T上,胶体金标记的抗原或抗体吸附在结合垫上,当待测样品加到试纸条一端的加样孔上后,通过毛细作用向前移动,溶解结合垫上的胶体金标记的抗原或抗体,再移动至包被的抗原或抗体的检测线处,如果样品中含有相应的抗体或抗原,包被在检测线上的抗原或抗体和胶体金标记物与样品中的相应抗体或抗原结合,形成免疫复合物,胶体金富集在检测线处形成一条可见的紫红色线。如果待检血清中没有相应抗体,胶体金标记物将不会与包被在检测线上的抗原或抗体结合,胶体金不会富集,检测线上不会出现紫红色色线。当样品与溶化了的胶体金标记物继续往上移动至对照线时,就与包被在对照线处的特异性抗体或抗原结合,在对照线上形成免疫复合物,出现一条胶体金富集的紫红色色线。试纸条如图1所示。

金颜辉等[20]建立的猪瘟金标免疫层析试纸测试30份标准阳性血清和18份标准阴性血清,结果阳性、阴性符合率100%。与ELISA试剂、dot2ELISA试剂及正向间接血凝进行比校试验,检测血清样品205份,结果阳性率ELISA为86.8%,金标层析法为85.4%,dot2ELISA为81.5%,正向间接血凝为58.5%。张长弓等[21]建立了检测口蹄疫(O型)抗体水平的免疫胶体金快速检测试纸法,应用该法与口蹄疫正向间接血凝抗原法对300份猪、鸡、鸭、牛、羊等血液或血清进行口蹄疫抗体水平检测试验,符合率达100%。方莹等[22]研制的RRRS抗体免疫金标试纸,用该试纸与PRRS2ELISA试剂盒分别对30份猪血清及血液样品进行抗体水平检测,结果完全一致。黄印尧等[23]建立了检测猪伪狂犬病抗体水平免疫胶体金快速检测试纸法,用该法与美国Idexx公司的猪伪狂犬病ELISA试剂盒,同时对16份猪血液或血清进行抗体水平检测,符合率达100%。同时使用金标法对100份猪血液和对应血清进行检测,结果也相同。王金春[24]建立的胶体金免疫层析法检测乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)试纸条只与HBsAg有特异性反应,与乙型肝炎病毒核心抗原、e抗原等无交叉反应,检测中国药品生物制品检定所HBsAg标准品,灵敏度可达1ng/mL。用GICA与酶免疫法比较检测了395份不同血清标本中HBsAg,两法符合率为99%。李月越等[25]用胶体金免疫层析法(GICA)和间接免疫荧光法(IFA)对同一份标本甲型及乙型流感病毒进行检测,结果得到较好的一致性。这种检测技术具有操作简单快速,特异性、敏感性好,可单份测定,结果直观,且可保存试验结果,无须特殊仪器等优点,适合于广大基层单位、医院、野外作业人员以及大批量时间紧的检测和大面积普查等,因此该技术具有巨大的发展潜力和应用前景。

4免疫胶体金技术的优点

胶体金制备容易,价格低廉。免疫金标记不仅可用于常规光镜,而且还可用于荧光显微镜。光镜应用的IGSS法是迄今最敏感的免疫组化方法。由于金颗粒具有很强的激发电子能力,还可用于扫描电镜和x射线衍射分析等。可以标记多种生物大分子物质,如抗体葡萄球菌蛋白A(SPA)、凝集素、多糖、多肽及其它蛋白质而不影响其生物活性。免疫胶体金对组织细胞的非特异性吸附作用小,故具有较高的特异性。胶体金是高电子密度颗粒性标记物,电镜下分辨率高,对超微结构遮盖少,并易与其他颗粒性结构相区别,具有较精确的定位能力。金颗粒大小可以控制,颗粒均匀,可进行双重和多重标记,即用不同大小的金颗粒分别标记不同的抗体,实现在同一张切片上观察两种以上的抗原,也可以和其他标记物配合进行双重或多重标记。由于胶体金本身有鲜艳的橘红色,可用光镜或肉眼观察试验结果,也可用分光光度计测定光吸收,进行定量分析。可在切片不同视野中根据金颗粒的数目来半定量抗原。应用于快速检测技术还具有操作简单快速,特异性、敏感性好,可单份测定,结果直观,且可保存试验结果,无须特殊仪器等优点。

5前景与展望

免疫胶体金技术是继3大标记技术(荧光素、放射性同位素和酶)后发展起来的固相标记免疫测定技术。免疫胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物,应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。近年来,该技术在医学、动植物检疫、食品安全监督等各领域得到了日益广泛的应用。免疫胶体金快速检测技术的灵敏性与ELISA基本相近,许多试验的敏感度都可达到1ng/mL或更低水平[26,27],但是有些试验往往不能达到如此的敏感度,灵敏度的提高无疑会拓宽胶体金免疫检测技术的检测范围。进一步提高免疫胶体金检测的敏感性、特异性、实现多元检测、实现定量或半定量检测将是未来胶体金技术的发展方向。

5.1进一步提高检测的灵敏度

采用信号放大系统如生物素-亲和素系统是提高检测灵敏度的有效方法之一。生物素-亲和素系统(BAS)是一种具有高亲和力、灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点的信号放大标记技术,研究证明生物素与亲和素依靠接触表面均一的多层膜来维系其稳定的结合。BAS应用于胶体金技术,其原理为带正电荷的链霉亲和素标记的带负电荷的胶体金颗粒能与生物素紧密结合,使检测信号在只有胶体金标记或只有BAS标记的基础上得到扩大[28]。殷涌光等[29]引入了生物素-亲和素系统,将胶体金复合的抗体作为夹心法的二次综合利用夹心式方法、胶体金复合的抗体和延长微生物与抗体的结合时间等办法显著提高了检测精度,将SPR生物传感器对大肠杆菌浓度的检测范围从106CFU/mL提高到了101CFU/mL。

5.2实现多元检测

可采用在同一膜上作多种项目测定和多项目的组合测定两种方式。一次检测可同时得到一组结果,这对于检测某些具有联检意义的物质具有很大的应用价值。Buechler等[30]用一膜包被多元抗体带的(包括阳性对照和阴性对照)的方法研制出可同时检测7种药物的免疫层析试纸条,能对乙型肝炎表面抗原、艾滋病病毒抗体和抗原,及丙型肝炎抗体等进行同时检测,对筛选献血者提供了很大便利。王荣等[31]建立的双重斑点免疫金渗滤法能同时检测HC和PRRS,对于当前猪病以混合感染为主的趋势,该法能快速、准确、特异的同时检测猪温和猪繁殖与呼吸综合征从而提高猪病的诊断效率。

5.3实现半定量或定量检测

定性检测的结果只有阳性和阴性,只能用于检测临床样本中是否有特定的生物成分存在,然而很多其它检测需要定量,例如,监控临床指标的变化或确定特定分析物的相对或绝对浓度。目前拥有胶体金定量检测的方法包括根据显色强度应用简单仪器进行定量,如应用反射的光密度计测量显色带或斑点的颜色强度,将颜色强度转化为数字指标,以实现定量的检测。Helm等[32]用TROPT快速检测仪能快速准确的显示肌钙蛋白2T(cTnT)的量,精度到0.2μg/L,已经成为患者床旁诊断急性心肌梗死的快速灵敏方法。储迅涛等[33]建立了胶体金免疫凝集抑制试验以定量测定尿液中的微量白蛋白。特异性免疫反应发生可导至金溶胶疑集,不同大小的金颗粒对光的反射不同,呈现不同颜色,可用比色测定来定量特异性免疫反应发生的程度。该法与全自动蛋白质分析仪上散射速率比浊法的结果进行了比较,两种方法的相关性达到99.5%。此外,还可通过应用不同灵敏度受体固定量的方式,观察各自显**况,将待测物含量确定于某一浓度区间,以实现半定量检测。Cho等[34]改进了胶体金免疫层析分析体系,建立了半定量化的条形码分析模型,能够显示分析物的浓度范围(如尿中人血清白蛋白),进行半定量化检测。

总之,免疫胶体金技术是继3大标记技术之后又一较为成熟且已得到广泛应用的免疫标记技术。作为一种检测技术与其他方法相比,如ELISA,RIA等,在许多方面具有无可比拟的优势,该技术操作简便、快速、特异,适用于广大基层单位并能在现场作检测和诊断。在今后的研究中,免疫胶体金技术将更进一步显示其巨大的优越性,同时也将在更广阔的领域内发挥其作用。