【转载】体外诊断试剂标准物质国内外的现状

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摘要：概述临床检验量值溯源体系和体外诊断试剂标准物质的国内外现状，分别叙述了血脂、酶学、血液学、分子生物学、免疫学、微生物学等方面的检测标准化。阐明加强体外诊断试剂标准物质建设的重要意义，不仅有利于诊断结果的准确一致，而且是做好体外诊断试剂技术监督的有力保证。
体外诊断试剂标准物质是实现体外诊断试剂监督检验数据和结果准确一致的主要工具，也是保证量值有效传递的计量实物标准。在完整的溯源、量值传递和校正过程中，标准物质起着复现量值、传递测量不确定度和实现测量准确一致的作用¨J。按照国家实验室认可准则的要求，对于检测的仪器和检验项目应有溯源或校正，只有使用标准物质才能保证检验结论准确一致。如果没有标准物质，同一个样品在不同实验室检测其结果就可能存在较大的差异，造成病人重复检测，增加病人负担，浪费医疗资源。随着国家对体外诊断试剂监督管理力度的加大和对检验技术要求的不断提高，对体外诊断试剂标准物质的需求和依赖也越来越强烈。因此，加强体外诊断试剂标准物质建设，不仅有利于诊断结果的准确一致，使各医院的检测结果具有可比性，而且也是做好体外诊断试剂技术监督的有力保证。
1标准物质的概念标准物质和有证标准物质于1977年由国际标准化组织(ISO)首次提出，随后经过多次修改，1992年10月在日内瓦召开的国际标准化组织和标准物质委员会第16次会议讨论修改了由A．J．Head博士提交的关于标准物质的陈述，批准通过了国际标准化指南30，在指南30中就标准物质和有证标准物质作出了定义。按照“国际通用计量学基本术语”和“国际标准化组织指南30”，标准物质有如下定义：
标准物质(ReferenceMaterial，RM)：具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校准设备，评价测量方法或给材料赋值的材料或物质。
有证标准物质(CertifiedReferenceMateria1．CRM)：附有证书的标准物质，其一种或多种特性值用建立了溯源性的程序确定，使之可溯源到准确复现的用于表示该特性值的计量单位，而且每个标准值都附有给定置信水平的不确定度。
基准标准物质(PrimaryReferenceMateria1．PRM)：这是一个比较新的概念，国际计量委员会(CIPM)于1993年建立了物质量咨询委员会(CCQM)，在1995年的物质量咨询委员会会议上提出了如下定义：一种具有最高计量品质，用基准方法确定量值的标准物质。
基准方法(PrimaryMethodofMeasurement，PMM)：具有最高计量品质的测量方法，它的操作可以完全地被描述和理解，其不确定度可以用国际单位制(SI)单位表述，测量结果不依赖被测量的测量标准。
从上述定义可以看出，标准物质具有2个显著特点：量值准确性和用于计量目的。这就澄清了标准物质的某些模糊概念，把那些不是用来校准计量器具和计量方法，同时也没有量值准确度要求的“产品系列标准样品”(如棉花、粮食、毛、麻等产品标准样品)与标准物质区别开来。
2体外诊断试剂标准物质国内外现状世界上最早开始研制标准物质的是美国国家标准和技术研究所(NationalInstituteofStandardsandTechnology，NIST，其前身为美国标准局NBS)，在l9世纪50年代已研制了数百种各类标准物质，但可用于临床检验的标准物质却只有SRM41右旋糖一种。由于医学领域对临床检验中标准化的呼声越来越高，国际组织和世界各国陆续在医疗领域中关注和开展标准物质研制和检验方法标准化的研究。
1968年NIST推出纯试剂标准物质——尿酸，此后，在1968—1978年的10年问，先后研究生产了19种临床用标准物质，鉴于社会对临床检验分析标准物质要求的迫切性，NBS加速了临床检验分析标准物质的研制；在1978～1993年间，新增加的分析标准物质，每5年以成倍数的趋势增加。
欧洲标准局重视临床检验用标准物质的研制。位于比利时的标准物质和计量研究所(In—stituteofReferenceMaterialsandMetrology，IRMM)自1970年后期开始了临床检验用标准物质的研制。1981年首先推出用于测定凝血时间的促凝血酶原激酶，随后，陆续研制出一系列标准物质。
英国的国家生物标准和控制研究所(NationalInstituteforBiologicalStandardsandControl，NIBSC)与世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)合作，研制了大量的涉及蛋白、抗体、激素等作为溯源的国际通用标准物质。其他国际组织和国家如国际原子能机构(InternationalAgencyofAtomicEner．gY，IAEA)、德国、挪威、日本等也先后开展了这方面的研究。
我国自80年代以来也开始研制临床检验标准物质。在1992年以前，主要是以血、尿、发为基体的提供无机成分和微量元素标准值的分析标准物质和纯试剂标准物质。目前，我国临床检验量值溯源基础建设比较薄弱，惟一具有比较完整参考系统的检验项目是胆固醇。该参考系统由卫生部北京老年医学研究所和国家标准物质研究中心制备的纯度标准物质(GBW09203a和GBW09203b)(一级参考物质)、卫生部北京老年医学研究所(BeijingInstituteofGeriatrics)建立的参考方法和该研究所制备的血清标准物质(GBW09138)(二级参考物质)组成¨。我国还有20余项与临床检验有关的国家一级标准物质，其中包括国家标准物质研究中心制备的尿素(GBW09201)和尿酸(GBW09202)纯度标准物质(ISO17511定义中的一级标准物质)，其余则主要是生物样品中无机成分标准物质。目前国内有关学者正在研究TG、HDL—C和LDL—C、酶催化浓度、血栓与止血指标等的标准化问题。在免疫检测的标准化方面中国药品生物制品检定所做了许多工作，中国药品生物制品检定所研制的供传染病、免疫测定等体外诊断试剂标准物质65种；在酶催化浓度的标准化方面国内有单位尝试丙氨酸转氨酶参考品等的研制；在血液检测的标准化方面卫生部临检中心血液室在全国范围内进行了血细胞计数测量溯源体系的建立；在核酸分子检测方面卫生部临检中心免疫室研制了HBV和HCV核酸的国家二级标准物质。但是，总的说来，我国的标准物质研制处于起步阶段，在提高国内诊断试剂质量和促进临床实验室的检测水平方面还有很长的路要走。
国内外主要的体外诊断试剂标准物质研制、提供机构见表1。



目前国际上临床检验项目大约有1000个，能溯源至sI单位的约有30个，它们主要是一些化学定义明确的小分子化合物，包括电解质类(如钾、钠、氯、镁、钙、锂离子等)、代谢物类(如胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、肌肝、尿酸、尿素等)和某些甾体类激素及甲状腺激素。
除上述少量项目外，其余多数临床检验项目因被测物质(主要是生物大分子类物质)的复杂性(如混合物、异构体等)，其一级参考测量过程的建立和一级参考物质的制备非常困难，其量值溯源只能停止在较低水平。这类检验项目目前国际上有以下几种情况：(1)有国际参考测量过程(非一级参考测量过程)，也有用此参考测量过程定值的国际参考物质，如糖化血红蛋白；(2)有国际参考测量过程，无国际参考物质，大约有3O个检验项目属于这种情况；(3)有国际参考物质及定值方案，但无国际参考测量过程，属于这种情况的检验项目约有250个；(4)还有大多数既无国际参考测量过程，也无国际参考物质。
上述能溯源至sI单位的检验项目的高级参考系统(一级和二级标准测量程序、一级标准物质和高准确度基质标准物质)多数由NIST、DGKC和BCR(现参考物质与测量研究所，IRMM)建立和保持。也有一些大学、医院、研究机构和生产厂家的专业实验室建立了自己的参考测量过程，因多年从事标准测量工作，故而达到了很高的计量学水平。不能溯源至sI单位的检验项目的参考系统(主要是参考物质)主要来自有关国际组织，如WHO、IFCC等。
2．1酶学检测的标准化2O世纪7O年代，IFCC成立了由著名学者Mos等组成的酶学委员会，开始将酶学的标准化寄希望于制定参考方法上。他们首先明确和界定了测酶活性(酶促反应)的各种条件。这是因为酶促反应速度的快慢不只是由酶浓度一个因素所决定，因此必须将一些条件或因素(如底物浓度、辅因子等)控制在最适条件、不至于因这些因素的变异而影响反应速度，另一些因素必须加以固定(如温度、缓冲液种类等)。该委员会第一个文件就是有关酶活性测定的总则。时问虽已过去了近30年，但此文件仍然是建立测定酶活性方法的指导性文件。测定酶活性的温度上一直争论：当时的文件规定测酶反应温度为30，理由是温度较低酶不易变性，其次30容易标化，因为金属镓的融点为2919，所以随后颁布的一系列具体的文件中测酶活性的最适条件都是根据30而定但在实际工作中，当室温超过25时，控制酶反应在30往往有困难。1999年IFCC在西班牙召开会员大会时，决定重新制定在37测定酶活性的参考方法。经多年努力，制定出6个文件，经IFCC会员投票通过后，在2002年颁布。
第1个文件名为“测定酶催化活性浓度参考方法的概念”，要求建立包括下列要素的测定酶催化浓度的世界参考体系。
参考测定方法：以现有的IFCC30的参考方法作为基础，制定了一套37的标准操作方法。
参考实验室网络：目前在世界上已成立一个由15个实验室组成的酶催化活性浓度测定的参考实验室网络，在计量学高水平上用参考测定方法对参考物质进行检测并定量。
参考物质：根据IFCC和IRMM合作协议，对现有的BCR参考物质重新定量。在此参考系统中，IFCC的酶参考方法测定具有最高的计量学水平，由此规定了其他水平的测定量。例如各个厂家校准品的定值方法，以及计量水平更低的质控品的结果。从理论上讲，各个医院检验科每日常规工作的结果，均应溯源至上述参考系统的结果。
第2到第6个文件分别讲述37下测定下列酶催化浓度的参考方法。第2个文件：IFCC测定肌酸激酶催化活性浓度的参考方法；第3个文件：IF—CC测定乳酸脱氢酶催化活性浓度的参考方法；第4个文件：IFCC测定ALT催化活性浓度参考方法；第5个文件：IFCC测定AST催化活性浓度参考方法；第6个文件：IFCC测定一谷氨酰氨基转移酶催化活性浓度参考方法。每一标准均详细叙述了实验室如何自行配制试剂溶液并应用手工操作分光光度计进行测定的参考方法。
2．2脂类检测的标准化血脂测定的标准化要求实验室之问的血脂测定结果具有可比性，达到规定的准确度，其核心是量值溯源。即在建立一个可靠的参考系统作为准确性的前提下，通过标准化计划将准确性转移到临床常规测定中去，使常规测定结果可溯源到参考系统所提供的准确性基础上来。目前美国已建立较完整的总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)测定的参考系统。其决定性方法都是由(NIST建立的核素稀释一质谱法(ID—MS法)，一级参考物质分别为NIST的SRM911b和SRM1595(三软脂酸甘油酯)；参考方法分别为CDC改进并维持的ALBK法和二氯甲烷一硅酸一变色酸显色法，二级参考物质有NIST的SRM909、SRM1951a、CAPRM026及CDC的多种冰冻血清。ALBK法除用于TC测定外，也用于高密度脂蛋白胆固醇(HDL—C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL—C)参考方法中的各组分胆固醇测定。与胆固醇参考方法实验室网络(CRMLN)成员不同，欧洲部分国家则使用ID—MS法作为测定胆固醇和TG的参考方法。由于TG测定中的变色酸显色反应步骤多、需要强酸试剂，最近CRMLN拟将此步改为酶法。HDL—C、LDL—C目前暂没有决定性方法和一级参考物质，只有参考方法和二级参考物质，参考方法为超速离心结合ALBK法，二级参考物质为CDC冰冻血清、NISTSRM1951a及CAPRM026。鉴于此参考方法所需血量大、操作复杂、影响因素多，CDC也在考虑进行改进与完善。
2．3血液检测的标准化2．3．1红细胞(RBC)和白细胞(WBC)计数国际血液学标准化委员会(ICSH)推荐使用电阻抗法半自动单通道血液分析仪计数细胞代替直接计数法，并在1994年进行了修订，将其确定为参考方法。现行RBC和WBC计数的参考方法，是将血液稀释一定倍数后用ICSH推荐的血液分析仪计数一定体积内的细胞数，并换算成每升血液内的细胞数。
2．3．2血红蛋白(Hb)测定1966年ICSH就已推荐氰化高铁血红蛋白(HiCN)法为首选参考方法，也可常规使用。其他方法如十二烷基硫酸钠测定法、叠氮高铁血红蛋白法等都必须通过HiCN法校正其结果。
2．3．3红细胞比容(PCV)测定PCV的常规测定方法有离心法、稀释法及电阻抗法等，其中以离心法重现性较好(微量离心法测定PCV的CV值为1％～2％)，但因残留血浆及其他因素的影响，特别是在病理情况下，其结果欠准确。ICSH曾于1980年推荐在Wintrobe管离心法的基础上用放射性核素标记的人白蛋白对残留血浆进行校正，并以此作为参考方法。该法是PCV测定最准确的方法，但因其实验要求的特殊性，非普通实验室所能开展。目前，ICSH制定了新的PCV测定的参考方法，即通过测定全血Hb浓度与平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)，间接得到红细胞比积(Hb／MCHC法)。
2．3．4网织红细胞(RET)计数目前RET计数的参考方法依然是目视计数法，即将血液标本作活体染色后制成血涂片，在显微镜下对红细胞逐个区分，计算出RET与RBC总数的比值。再根据ICSH参考方法所计数的RBC数，将RET相对数换算成每升血液中的绝对数。
2．3．5血小板(PLT)计数现行的PLT计数的参考方法是ICSH制定的PLT／RBC比值法，即以RBC代替乳胶颗粒作为校准物，计数PLT／RBC值，通过ICSH参考方法计数RBC浓度，再以PLT／RBC比值乘以RBC浓度即为PLT浓度。
2．3．6白细胞分类计数(DC)目前，白细胞DC的参考方法仍然是手工分类法，即将血涂片进行瑞氏染色后，在显微镜下对各种WBC进行分类。
2．4核酸检测的标准化近年来，病毒核酸检测实验(NAT)被越来越广泛地应用于血源性制品的病毒筛查，抗病毒治疗疗效及预后监测等方面。由于该方法过程复杂，且含有酶学反应，极容易受到检测样本的基质效应和检测病毒的基因变异等影响，导至了不同的实验室在应用不同方法学进行NAT检测时，在量值、灵敏度和特异性方面差异很大。为减少检测的变异，并使不同实验室，不同方法检测的结果具有可比性，就必须使检测标准化。标准化检测必须有由参考物质和参考测量程序组成的参考体系。
由于核酸不能单独应用物理和(或)化学的方法进行准确描述，因此必须应用生物学反应来补充描述其特性，所以迄今为止传统意义的一级参考测量程序(物理和化学方法)和一级参考物质在NAT检测中尚未存在。尽管如此，WHO已经通过多中心研究建立了HCVRNA、HBVDNA、HIV一1RNA、B19DNA和HAVRNANAT等核酸国际参考物质，并依据此项标准建立了应用于国家或地区以及厂家工作校准等几种不同等级、不同检测方法的工作制剂，从而使当前不同实验室、不同检测方法得出的检测结果的表述单位(如genomeequivalents／mL，copies／mL，PCRdetectableunits／mL)得到统一并具有可比性。
WHO于1997年建立了第一套HCVRNA核酸检测用国际标准，分别于1999年、2000年、2002年和2003年建立了HIV一1RNA、HBVDNA、HumanParaparvovirusB19和HAVRNA核酸检测用国际标准。WHO为病毒NAT制定的国际标准，来源于稀释后冻干分装的且含灭活野生型病毒的人混合阳性血浆，表述单位通常为IU。这种标准物质量值为WHO经多中心研究确定其可以作为第一个国际标准物质或参考制剂后，通过主观方式赋予的一个标准数值，后来的替代标准则以第一个标准值为标准继续通过国际多中心合作来定值。规定Iu可以使某种物质的生物活性在国际上使用同一种计量单位表示，从而使不同国际单位的单位体系具有互通性。
目前，制备核酸检测用国际标准已经程序化，上述HCVRNA、HIV一1RNA、HBVDNA、HumanPara—vovirusB19和HAVRNA的第一套国际标准，都是按照WHO的固定程序制备的。其过程包括材料的选择和分装、稳定性和均匀性检验和多中心合作研究定值、WHO认可三个阶段。
2．5微生物检测的标准化
对于微生物检测的标准化，NCCLS发布了进行药敏试验的推荐方法，而在ATCC中则保存和鉴定了大量的标准菌株。
2．6部分临床生化检测的标准化国内外临床生化检测的标准物质和参考方法的研究中取得了一定的进展，表2简单的列举了部分检测项目的一级和二级参考测量程序.



2．7免疫检测的标准化
对于免疫学检测中的项目如表面抗原等，由于没有确定的参考方法，大多采用多中心定值的方法，采用的方法则主要为ELISA等。标准物质制备的具体流程和核酸一致，其过程包括材料的选择和分装、稳定性和均匀性检验、多中心合作研究定值、WHO认可几个阶段。如在表面抗原标准物质制备中使用的试剂和方法见表3。



3结论
综上所述，从1960年末期国外开始全面推出临床检验用标准物质起，到现在已有30多年。从研制已知化学组成的纯标准物质，到含基体的分析标准物质，从研制一般的无机和有机成分的实物标准物质，到化学组成尚未充分认识的具生物活性的酶和蛋白质的标准物质及DNA的标准物质，在这30年内临床检验标准物质有长足的发展。但与保护健康、预测和诊断疾病发展的需要，尚有很大距离。临床检测项目约有1000种，此数与现已具有标准物质的种类相比，差距是显而易见的。标准物质的研究不但是一项高水平的研究，而且需要较大的投入。临床用标准物质制备困难，其测定成分和基体也较不稳定。因数量和价格的关系，难以在日常检验中作为常规的溯源物质。大量的次一级的质控物和校准物应运而生，作为标准物质的补充而被广泛使用。由于目前体外诊断试剂标准物质缺口太大，远远不能满足市场及监督检验的需求，因此，与临床检验有关的标准物质的研制任重而道远。