巢式PCR变性梯度凝胶电泳( nested PCR-DGGE)

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一、引言
巢式PCR变性梯度凝胶电泳( nested PCR-DGGE)是将巢式PCR与变性凝胶梯度电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)结合起来的一种PCR技术方法。DGGE是一种电泳分析系统,利用序列不同的DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶中解链温度不同的原理,通过梯度变性胶将DNA片段分开。当双链DNA分子在变性凝胶中进行电泳时,其解链的速度和程度与其序列组成密切相关,相同长度的双链DNA分子由于碱基对组成的不同,解链所需要的变性剂浓度也不同,当某一双链DNA序列迁移到变性凝胶的一定位置,并达到其解链温度时,即开始部分解链,部分解链的DNA片段在胶中的迁移速度急剧降低。因此具有不同序列的DNA片段则停留于凝胶的不同位置,形成相互分开的条带图谱。理论上只要选择的电泳条件足够精细,最低可检测到只有一个碱基差异的DNA片段(≤500bp)。
二、材料
①模板:基因组DNA或CDNA。
②dNTP混合液:每种脱氧核糖核苷酸的浓度为2.5mmol/L。
③四条特异引物:两条外引物,两条内引物,浓度均为10mol/L
④ Taq dna聚合酶。
⑤10×PCR缓冲液:15mmol/ L MgCI2,500mmol/IKC,100mmol/ L Tris-Cl,0.1%(体积分数) Triton X-100
⑥高压灭菌去离子水。
⑦PCR扩增仪。
⑧DGE( Bio-Rad dcode系统),丙烯酰胺、双丙烯酰胺、去离子甲酰胺和尿素、溴化
三、方法
1.引物设计
巢式PCR的引物设计原则与常规PCR相同。通常内引物与外引物之间的间隔距离也没有统的要求,具体情况根据每个实验而定。
2.模板
一般使用经过提取的基因组DNA或合成的cDNA
3操作方法
①设立50l的PCR反应体系。在0.25ml的PCR管中,分别加入:
10×PCR缓冲液       5pl10mol/L的外引物(P1、P2)各1ul
2.5mmol/L的dNTP混合液             1 ul DNA或cNA模板       5ul
Tag dNA聚合酶(5U/l                0. 5ul H2O                    至50ul
如果PCR仪没有热盖,在反应液上加一滴矿物油(约50)。将PCR试管放入到PCR仪上
②设置PCR反应条件。
预变性        94℃,3min
变性           94℃,30min
退火           55℃,30s
延伸           72℃,60s         30个循环
延伸           72℃,7min
PCR反应中的温度要根据具体反应而定,一般来说每分钟合成1000左右。
③进行第二轮PCR反应。在0.25m的PCR管中,分别加人
10×PCR缓冲液             5cDNA模板
2.5mmol/L的dNTP混合液           1ul Taq dna聚合酶(5U/pl)            0.5ul
10umol/的内引物(P3、P4)       各1ul       H2O                              至50ul
PCR反应条件同第一轮。
④PCR产物的检测和分析
DGGE系统要求在聚丙烯酰凝胶中对待测DNA片段电泳,电泳的温度维持在仅低于待测解链区域T。值几摄氏度。对绝大多数天然的DNA片段60℃是合适的。
制备10%聚丙烯酰胺凝胶(丙烯:双丙烯=37.5:1),变性剂梯度范围为30%~60%(100%变性为40g/dL甲酰胺及7mol/L尿素),呈线性梯度增加,方向与电泳方向平行。
DGGE电泳凝胶制备过程如下。
a.灌胶玻璃和垫条的处理:用清洁液仔细清洁玻璃板,横擦竖擦3遍,用自来水彻底清洗后再用去离子水冲洗干净,操作时必须戴手套,取板时握住板的边缘,以避免手上的油脂印在板的工作面上。
b.灌胶玻璃板的安装与封闭:将长板平放在桌上,将垫条放置于两侧,放上短玻璃板,对齐。参照 Bio-Rad Dcode system说明书操作。
c.凝胶板的制备:用50×TAE、40%丙烯酰胺双丙烯酰胺(37.5:1)配制,分别加入高浓度变性剂和低浓度变性剂的8%聚丙烯酰胺凝胶,凝胶中的TAF浓度为1倍,以42g尿素和40ml甲酰胺为100%变性剂。将两种变性剂浓度的8%丙烯酰胺溶液分别吸入两个注射器,将两个注射器放在梯度形成器的正确位置,缓慢且均匀地转动轮子,以便形成线性梯度,直至灌满至玻璃板顶部,然后立即插入梳子待胶凝固,凝胶大小选用16cm×16cm×0.75mm。
d凝胶老化:凝胶室温放置2h,取出梳子,用1×TAE溶液冲洗凝胶孔,以除去可能存在的未聚合的丙烯酰胺。
DGGE电泳过程如下
a.预热缓冲液:配制7L1×TAE缓冲液,上样前将缓冲液加热到60℃。
b.加样:取9lPCR纯化产物与1l10×上样缓冲液混合,注入到加样孔底部。
c.电泳:电泳温度为60℃,变性剂浓度以0~100%为最大区间,电压从120~200V,电泳时间4~8h,经过多次垂直电泳实验来选择最佳实验条件
d.聚丙烯酰胺凝胶的浓度、电泳时间可主要根据所分离的PCR扩增片段的大小来决定,染色方法除用银染外,还可用溴化乙锭、 SYBR Green I核酸染色液(1:10000稀释度,Rockland,USA)等方法。
DGGE电泳成像如下
DGGE指纹图谱构建采用 DCode基因突变检测系统( Bio-Rad,美国),溴化乙锭或其它方法染色后,在凝胶成像系统中扫描照相,利用Bo1D++软件对DGGE指纹图谱进行分析。
四、注意事项
一般认为,扩增片段大小对DGGE分析有较大的影响。当片段长度大于500bp时,会使DGGE的分辨率下降,200bp左右的片段被认为是分离效果最好的片段。
五、应用与小结
DGGE技术主要用于微生物生态学研究,目前被认为在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。与传统方法相比,DGGE技术能够快速、准确地鉴定在自然生境或人工生境中的微生物种群,并进行复杂微生物群落结构演替规律、微生物种群动态的评价分析。由于DGGE具有可靠性强、重现性高、方便快捷等优点,目前已经成为微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具,并被广泛用于活性污泥、生物膜、土壤、底泥等环境样品中的微生物多样性检测和种群演替的研究。通常通过研究16 SrNA的序列多态性来反映微生物的种群构成2。但DGGE技术分离的DNA片段大小有限,其一这些序列只能提供有限的信息,限制了用于系统发育分析和探针的序列信息量。其二是分辨率有限。DGGE通常显示群落中优势种类的DNA片段,只有占整个群落细菌数量约1%或以上的类群能够通过DGGE检测到。含量较低的细菌种群只能通过设计属、种或株特异性引物来实现DGGE检测。其三是由于某些种类细菌16 SrNA存在多拷贝或者异源双链,从而使DGGE图谱上单一菌出现多个条带,导至自然群落中微生物数量的过多估计。

文章来源：巢式PCR变性梯度凝胶电泳( nested PCR-DGGE)-萝卜卜卜卜卜

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