培养基：发酵的基石 基因工程技术和大规模培养技术的有机结合，使得原本含量低的天然蛋白能够大量生产，通过基因工程技术将编码目的蛋白的核酸序列导入到宿主细胞中，使其大量表达。重组大肠杆菌细胞高密度培养是获得高外源性蛋白产率的一种重要策略，该技术不仅可以减少培养体积，简化下游的分离提取，还可以缩短生产周期、减少设备投入，降低生产成本和提高生产效率。随着后基因组时代对蛋白质快速生产的需求增加，人们越来越重视蛋白质的生产过程，基于系统生物学，通过多维度策略，重塑和优化传统工艺，建立更全面、更高效的重组蛋白高密度发酵工艺。 培养基作为大肠杆菌生长和产物合成的基础原料，堪称菌体生长和蛋白生产的 “粮草”，对大肠杆菌生长和重组蛋白表达的影响至关重要。 培养基在发酵工程中具有重要的作用和地位，为蛋白表达提供了必需的营养物质并创造了适宜的生长环境。能否设计出好的发酵培养基，作为提高产量、降低生产成本的主要手段之一，是发酵产品工业化成功中非常重要的一步。
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大肠杆菌发酵培养基组成 ● 碳源 碳源的作用是构成细胞物质和代谢产物的骨架、提供细胞生理活动所需的能量。 •1. 培养基中的碳源主要有葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖等，其中葡萄糖是目前大肠杆菌发酵中最常用的碳源，选择葡萄糖作为碳源需要关注： ①合适的葡萄糖浓度：高浓度的葡萄糖产生葡萄糖效应，生成乙酸等代谢副产物，反而可能影响菌体的生长和重组蛋白的表达量及生物活性。 ②碳氮比（C/N）：C/N 一般指培养基中碳源和氮源的浓度比值。C/N 偏小，会导至菌体生长旺盛，易引起菌体衰老和自溶；C/N 偏高，会影响菌体的生长；C/N 对菌体的生长和蛋白的合成的影响不同，不同的发酵阶段可能需要不同的 C/N；C/N 还会影响发酵过程 pH 的变化，高 C/N 会引起 pH 的下降，低 C/N 会引起 pH 的上升。
● 氮源 氮源的作用是用于菌体细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物的合成。
•2. 有机氮源作为培养基的重要组成部分，其质量极易受到来源和生产工艺的影响。不同厂家、不同品系的有机氮源产品其成分和营养结构也存在差异，往往可能对发酵造成较大的影响。
培养基中不同有机氮源对大肠杆菌摇瓶发酵生产重组蛋白的影响。大肠杆菌发酵生产某重组蛋白的培养基优化过程中，维持培养基中其它成分相同，单因素考察不同有机氮源与参比组分硫酸铵对菌体生长和蛋白表达量影响的差异：一些有机氮源相对硫酸铵对菌体生长和蛋白表达更为有利，但发现不同来源、不同厂家的有机氮源差异极为显著。 •3. 外源蛋白表达过程中易受宿主蛋白酶的影响而被降解，培养基中添加蛋白水解物或者蛋白胨等富含氨基酸、多肽等的组分，既作为大肠杆菌生长和代谢的氮源，同时可以做为蛋白酶的底物，与目的蛋白竞争性地结合细胞蛋白酶，从而减少目的蛋白的降解。 •4. 氨基酸是蛋白合成的基本原料，在合成目标蛋白的过程中，在氨基酸供应不足情况下，大肠杆菌优先合成菌体必需氨基酸，可通过补加富含特定氨基酸来增加外源蛋白的表达；在考虑氨基酸或富含氨基酸的复合有机氮源物质的特定补加时，一方面可根据目标蛋白氨基酸组成来选择性补充需求量较高的氨基酸或富含该氨基酸的复合有机物；另一方面可利用特定检测分析手段，对发酵过程中培养基各氨基酸组分的消耗进行动态监测，并与菌体产量、重组蛋白表达量与蛋白活性等关键指标进行关联分析，明确关键氨基酸的种类，通过在培养基中添加该关键氨基酸，或通过对复合氮源氨基酸的全分析，选择合适的复合氮源以实现特定氨基酸的补充。 ● 无机盐及微量元素 无机盐的作用包括维持 pH 和渗透压，并参与细胞膜和核酸的合成，无机盐是生物维持自身新陈代谢的重要元素。一些微量元素虽然需求量很少，但对微生物的生长代谢和产物合成的作用不容小觑。
无机盐或微量元素浓度过低或过高都不利于菌体生长和蛋白表达。在设计培养基时，必须综合考虑各种无机盐或微量元素的最佳配比和浓度，同时也可以通过补料培养的方式既避免初始营养成分浓度过高导至的抑制现象，又防止限制性营养物质的缺乏。
金属离子对大肠杆菌高密度发酵生产重组蛋白的影响。 瀚海新酶某项目案例中：大肠杆菌发酵罐高密度发酵产某酶类，培养基中以流加的方式补充不同浓度 Co2+和 Mn2+。经两种金属离子的添加和浓度的优化，蛋白比活力提高了 330%，单位菌体的总活性提高了 500%，菌体产量提高了 13%，总产量提高了近 580%；说明两种金属离子不仅一定程度上促进了菌体的生长，且极其显著提高了单位菌体的蛋白表达量和蛋白比活力。 ● 辅因子 一些辅因子也对大肠杆菌的生长代谢或重组蛋白的表达起着十分重要的作用，在培养基中添加辅因子对提高大肠杆菌菌体密度和重组蛋白产量或活性具有十分积极的意义。 •1. 维生素作为促生长因子，可促进大肠杆菌的生长和代谢，减少菌体的死亡；由于外源性重组蛋白的大量表达极容易对宿主产生严重的代谢压力和毒性，造成菌体的死亡，进而限制菌体的产量，在这种场景下，可考虑通过一些维生素的补充来提高菌体活率。 •2. 一些辅因子对重组酶发挥生物活性起着关键作用，其活性依赖于辅因子在活性位点中的催化作用。按其与酶结合的特点，又可分为辅酶和辅基两种类型。一般可通过对蛋白结构的分析或数据库的查询来明确关键辅因子，通过系统优化来精确控制辅因子的最佳添加种类和浓度；并结合适当的培养条件及补料策略，保持最佳的辅因子的添加策略，最终达到提高重组酶的质量和产量的目的。 •3. 甘油、山梨醇，阿拉伯糖醇，肌醇及海藻糖，氨基酸及氨基酸衍生物等的添加，可作为辅助因子起到调节渗透压、改善细胞膜通透性、促进重组蛋白可溶性表达，提高蛋白产量的作用。
辅因子对大肠杆菌发酵生产重组蛋白的影响。 瀚海新酶的某案例中：通过大肠杆菌高密度发酵生产某重组蛋白,在培养基中分别添加作为该蛋白的辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和黄素单核苷酸（FMN），蛋白的活力和发酵水平得到非常显著的提升。 0 2 大肠杆菌发酵培养基的优化思路 培养基的设计和优化，需要考虑的影响因素众多，且各因素常存在交互作用，是一个多因素和多参数的复杂过程。涉及材料选择、工艺参数调整以及最终产品性能评价等多个方面。面对不同的大肠杆菌菌株和复杂多样的重组蛋白，需要通过对关键影响因素的分析和系统的实验设计，才能获得良好的培养基。
培养基优化的影响因素考察 培养基优化流程： 通过文献调研和培养基分类，收集不同的培养基组合； 针对各个培养基进行筛选和组合，选择较优培养基； 单因素试验（减除、添加、替代、添加量）和分析确定重要影响因素； 基于统计学的多因子实验设计和分析，获得最佳培养基； 验证，确定最佳配方。
瀚海新酶的某案例中：通过大肠杆菌表达某重组酶，摇瓶中初始培养基下活力仅为 26.46U/ml，针对培养基的优化，通过培养基筛选、单因素试验和多因素的 DoE 设计试验，对关键因素进行优化，获得最佳的培养基，应用于发酵罐高密度发酵，并结合发酵条件和补料的优化，酶活力达到 4200U/ml 以上。
03 瀚海重组蛋白发酵CMO服务
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[1]Iman Shahidi Pour Savizi ， Tooba Soudi1，Seyed Abbas Shojaosadati. Systems biology approach in the formulation of chemically defined media for recombinant protein overproduction. Applied Microbiology and Biotechnology.2019.Volume 103, pages 8315–8326.
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