等温核酸扩增技术 (INAATs) 是一种可替代 PCR 进行核酸扩增的技术，快速且无需热循环，可在恒定温度下对核酸进行指数扩增。目前有许多种等温核酸扩增技术，包括环介导等温扩增（LAMP）、滚环扩增（RCA）、多重置换扩增 / 全基因组扩增（MDA-WGA）、基于核酸序列的扩增 (NASBA)、转录介导的扩增(TMA)等、重组酶聚合酶扩增 (RPA)等。 等温扩增技术的逐渐广泛使用推动了分子诊断试剂开发领域的新进展。基于 INAATs 的分子诊断试剂在即时检测 (POC) 、基于实验室和基于现场的诊断试剂开发中起着重要作用。INAATs 具有快速的周转时间，样品处理过程简单，因此成为传染病和遗传疾病诊断试剂的常用开发工具。许多下一代诊断设备采用 INAAT 技术在床旁进行即时检测 (POCT)。 RPA技术原理 重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）是等温核酸扩增技术之一。RPA技术由英国TwistDx公司于2006年首次推出。其开发的初衷是为了提供一种快速、简便、灵敏的核酸扩增方法，以弥补PCR技术在复杂设备和时间消耗上的不足。 RPA技术的核心在于利用多个重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶在恒温条件下进行靶序列的特异性扩增，由两个引物启动。具体来说，重组酶与引物结合形成核蛋白丝（nucleoprotein filaments），这些核蛋白丝能够识别并结合到双链DNA的目标区域。接着，单链结合蛋白（SSB）稳定打开的DNA双链区域，使之暴露出单链DNA模板。随后，链置换DNA聚合酶在单链模板上延伸，引物从而完成扩增过程。整个反应通常在37-42℃的恒温条件下进行，无需热循环仪，非常适合在现场条件下检测各种病原体。通过将反转录酶纳入反应，RPA也可以用来检测RNA靶标。可以使用多种方法来检测扩增的DNA，如终点法检测、实时定量分析、侧向流动测定以及CRISPR-Cas系统。 图 1. 重组酶聚合酶扩增（RPA）。在ATP存在的情况下，由UvsX和UvsY蛋白组成的重组酶复合物与引物结合开始RPA反应。该复合物在DNA上寻找同源序列，并促进DNA链的打开和引物的结合。单链DNA结合蛋白（Gene 32蛋白）稳定产生的D-环结构，允许DNA聚合酶在置换DNA链的同时延伸引物。 RPA技术优点 与传统的PCR技术相比，RPA具有以下显著优点： 1. 低温操作：RPA技术在恒定的低温（通常为37-42°C）下进行扩增，无需热循环仪，这简化了设备需求，降低了实验成本。 2. 快速反应：RPA反应的扩增速度非常快，通常在20到40分钟内即可完成，而传统PCR通常需要1-2小时。这使得RPA特别适合于需要快速结果的应用场景，如现场检测。 3. 高灵敏度：RPA技术具有极高的灵敏度，可以检测到非常低拷贝数的目标核酸。这使得RPA在早期病原体检测和低浓度样本的分析中具有显著优势。 4. 特异性强：通过使用特定的引物和探针，RPA能够实现高特异性的核酸扩增，减少非特异性扩增的可能性，提高检测准确性。 5. 便携性：由于RPA技术不需要复杂的设备和高温条件，它可以在便携式设备中实现。这使得RPA特别适合于现场检测、野外研究和资源有限的环境中的应用。 6. 适用性广：RPA技术可以应用于多种类型的样本，包括血液、唾液、尿液、组织样本等，且不需要复杂的样本前处理步骤。 7. 兼容性强：RPA技术可以与多种下游检测方法兼容，如荧光检测、侧流免疫层析和电化学检测等。这为RPA在不同检测平台上的应用提供了广泛的可能性。 8. 易于操作：RPA反应体系相对简单，操作步骤少，对操作人员的技术要求低，适合在各种实验室环境中推广应用。 RPA应用方向 RPA技术因其高灵敏度、快速性和操作简便性，在多个领域展现出广阔的应用前景： 1. 临床诊断：RPA技术可用于快速检测病原体DNA或RNA，包括病毒、细菌和寄生虫等。例如，RPA在新冠病毒（SARS-CoV-2）的快速检测中发挥了重要作用。 2. 食品安全：RPA可用于检测食品中的病原微生物或转基因成分，确保食品安全。 3. 环境监测：RPA技术应用于检测环境中的污染物或病原体，如水体中的病原菌和病毒。 4. 法医学：RPA可用于快速扩增和检测法医样本中的DNA，帮助破案。 5. 农业：RPA技术在农业中用于检测植物病害和转基因作物，保障农业生产安全。 RPA最新进展 近年来，RPA技术在多个方面取得了显著进展： 1. 便携式设备：随着便携式检测设备的发展，RPA技术在现场检测中的应用变得更加广泛。例如，结合微流控芯片技术的便携式RPA设备可实现快速、现场的检测。 2. 多重检测：研究者开发了多重RPA技术，可同时扩增和检测多个靶标，提高了检测效率和信息量。 3. 自动化和高通量：自动化RPA平台和高通量检测系统的出现，使得RPA技术在大规模检测中的应用成为可能。 4. 荧光和比色检测：结合荧光探针和比色法的RPA检测技术，提高了检测结果的可视化和可靠性。 RPA未来展望 RPA技术作为一种新兴的核酸扩增技术，未来发展前景广阔。以下是一些可能的发展方向： 1. 提高特异性和灵敏度：通过优化反应条件和引物设计，进一步提高RPA技术的特异性和灵敏度。 2. 拓展应用领域：RPA技术在更多领域的应用，如个体化医疗、疾病监测和公共卫生等。 3. 集成化和智能化：将RPA技术与智能手机、物联网等技术结合，实现更加便捷和智能的检测系统。 4. 新型报告系统：开发更为直观和灵敏的报告系统，如基于纳米材料和生物传感器的检测方法。 总之，重组酶聚合酶扩增（RPA）技术以其独特的优势和广泛的应用前景，正在成为分子生物学和生物技术领域的重要工具。随着技术的不断进步和应用的不断拓展，RPA技术将在未来发挥更加重要的作用。 赛默飞RPA新品推荐 Invitrogen Lyo-ready RPA Kit（货号：A72127/ A72128）包含等温重组酶聚合酶扩增（RPA）所需所有组分（无甘油形式），具有高反应灵敏度，高特异性和对抑制剂的高耐受性。Lyo-ready RPA Kit各组分以单管提供，可提供高灵活性以用于RPA反应优化，兼容多种类型的病原体（RNA / DNA），包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、流感、麻疹和其他病原体。 ➣ 高灵敏度 – 可检测低至一个拷贝的靶标样本 ➣ 高特异性 – 可在RNA / DNA混合物中检测并扩增单一靶标 ➣ 快速 - 20分钟内即可完成靶标扩增 ➣ 性能强劲 - 即使从含抑制剂的RNA / DNA样本中也能高效扩增 ➣ 灵活 – 单独组分可灵活优化RPA或RT-RPA反应
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