比较基因测序技术的1，2，3，4代，代代不一样！

第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解），为方便起见，统称为Sanger法。在1977年，Sanger测定了第一个基因组序列——噬菌体phiX-174，全长只有5,375个碱基。

虽然与今日的技术比起来根本不算什么，但自此之后，人类获得了窥探生命本质的能力，并以此为开端真正步入了基因组学时代。

核心原理：由于双脱氧核苷酸(ddNTP)的3’位置脱氧，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影，根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

在每个反应体系中，ddNTP相对于dNTP是很少的，所以只有部分新链在不同的位置特异性终止，最终就会得到一系列长度不一的序列。

Sanger法测序读长长、准确度高，但是通量不高。总的来说，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1,000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本偏高（相对基因组大小），通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是理想的测序方法。

优点：一代测序准确性最高，几乎达到100%，是公认的测序技术的“金标准”。

缺点：一代测序的缺点是速度慢、费用高、只能同时测序一条DNA模板。

费用：3000元左右。

二代测序技术在大幅提高了测序速度的同时，还大大地降低了测序成本，其测序成本近五年来从几千元1G（1G即10亿碱基）降到了到今天的40多块钱1G数据量，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但其序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只100bp-150bp。

目前illumina的测序仪占全球75%以上，以NextSeq、HiSeq、NovaSeq等系列为主。它的机器采用的都是边合成边测序的方法，读长短（50-300bp）；准确度达99.9%；通量很高。以Illumina平台为代表的第二代测序技术实现了高通量测序，有了革命性进展，使得大规模并行测序成为现实，极大推动了生命科学领域基因组学的发展。Illumina循环SBS法(cycle SBS)即SBRT(Sequencing By Reversible Termination,可逆终止)的核心技术是DNA合成的可逆性末端循环，即3'-OH可逆性的修饰和去修饰。

基本原理：将dNTP的3'-OH以叠氮基团RTG(Reversible Terminating Group,可逆末端基团)进行修饰；将4种碱基分别与不同的荧光分子连接；DNA合成时，RTG能起到类似于ddNTP的作用终止反应；每次合成反应终止并读取信号之后，洗脱RTG和荧光分子，进行下一轮循环。

但是第二代基因测序技术的局限性也显而易见：一是需要分子扩增，二是使用光学系统检测，三是必须有足够多的样本才能降低测序成本，这些部分限制了基因测序的推广，阻碍其走向产品和服务的基因消费时代。

但其技术硬伤还在于：

1、读长短的缺点导至测序过程中含量较少的序列信息可能会丢失，且PCR过程中有一定概率会引入错配碱基；

2、想要得到准确和长度较长的拼接结果，需要测序的覆盖率较高，导至结果错误较多和成本增加。

Illumina测序读长短、通量高、准确度高，在进行基因组组装或者结构变异分析的时候没有优势，可用作三四代测序read的纠错。

优点：二代测序高通量，非常适合进行基因组、转录组以及表观遗传学方面的检测。除此以外，单条序列测序成本非常低廉，仅仅相当于第一代测序技术的1%。

缺点：二代测序检测序列较短，测序前需要PCR扩增，错误率比一代稍高，为了降低错误率，可以使用Sanger测序技术对第二代测序技术检测出的变异进行验证。这也正是Sanger测序沿用至今的原因。

费用：5000-8000元左右。

以PacBio公司的SMRT单分子测序技术为代表。与前两代相比，最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，超长读长，是二代测序技术的100倍以上。这种纳米孔单分子测序仪还有另一大特点，它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像二代测序方法那样需要事先对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。

基本原理：Pacbio仍然采用边合成边测序的原理，但实现了两个重要的技术突破。一个是将荧光分子标记在磷酸上，这样在反应停止且捕获荧光信号以后，可直接随磷酸基团脱落，解决了因噪音污染导至的读长很短的问题；二是由于不需要PCR扩增，信号的有效提取成为了关键。通过引入零模波导孔（ZMW）技术解决这一问题。在纳米室底部有一个孔径70nm的小孔，由于远远小于激光的波长，所以激光从底部照射时，只会照亮一个小的区域，提高了信噪比。

SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但这么快的测序速度也带来了一些明显的缺点——测序错误率比较高（这几乎是目前单分子测序技术的通病），可以达到10%-15%，而且以随机的缺失序列和错位居多。

优点：Pacbio三代测序设备在DNA 序列片段读长上优于二代设备，测序读长长、通量高、可进行甲基化的直接测序。

缺点：在准确度上较二代设备差，准确度不高，但可通过测序深度弥补，GC偏差低，

费用：单样本的测序成本一直居高不下。

以Oxford Nanopore Technologies为代表的纳米孔测序技术与其他测序技术不同的是，它基于电信号而不是光信号。经历了三个主要的技术革新：一、单分子DNA从纳米孔通过；二、纳米孔上的酶对于测序分子在单核苷酸精度的控制；三、单核苷酸的测序精度控制。主要是通过ssDNA或RNA模板分子通过纳米孔而带来的“电信号”变化推测碱基组成进行实时测序。

基本原理：将在某一面上含有一对电极的特殊脂质双分子层置于一个微孔之上，该双分子层中含有很多由α溶血素蛋白组成的纳米孔（直径2.6nm），只能容纳一个核苷酸通过，并且每个纳米孔会结合一个核酸外切酶。当DNA模板进入孔道时，孔道中的核酸外切酶会“抓住”DNA分子，顺序剪切掉穿过纳米孔道的DNA碱基，每一个碱基通过纳米孔时都会产生一个阻断，根据阻断电流的变化就能检测出相应碱基的种类，从而进行实时测序，最终得到DNA分子的序列。

Nanopore特点是单分子测序，通量高、测序读长长（超过150kb），测序速度快，测序数据实时监控，机器方便携带等。但其单芯片测序成本还是在几百美金以上，准确度低，不可通过测序深度弥补，但可通过Illumina read 纠错。