（超）多重PCR的技术门槛，到底高不高？

（超）多重PCR的技术门槛到底高不高，做过PCR的人都明白，做单重PCR都会有二聚体和非特异扩增的存在，更何况一管内扩增几千重，那二聚体和非特异扩增简直就是灾难级别的，根本看不到目标条带，二聚体完全掩盖住了目标条带扩增。目前，突破多重PCR技术壁垒，基本可以归纳为2个方向：生信设计和实验改造。

一、生信算法

很多科研团队开发了很多多重PCR引物的算法和软件，如下表，MultiPLX计算现有PCR引物的相容性评分，并对多重PCR引物进行分组；Oli2go将多个序列作为输入，为所有序列设计多重引物和探针，其特异性检查不仅限于单个物种，而且可以在多种物种上进行；MPprimer和PrimerStation设计多重引物组，其扩增子的大小不同，以便通过电泳分离；MCMC-ODPR采用Markov chain Monte Carlo优化方法，围绕单核苷酸多态性设计多重简并引物，注重引物的可重复使用性，以降低成本。

最引人注目的，应该是阅尔基因与济大学附属上海肺科医院任胜祥教授合作在Nature Communications上的，一种二聚体似然估计的模拟退火设计（SADDLE）的算法。在大型扩增子法测序panel中首次实现了超低的引物二聚体水平，研究团队进一步设计了384-plex panel（768 对引物）进行验证，优化流程耗时60分钟，而最终实验观察到的引物二聚体比例仅为1%。

二、实验优化

实验优化的逻辑其实很简单，多重PCR就好比多个鱼钩去钓鱼，现在问题出在鱼钩太多，那就对鱼钩进行优化，上面说的生信分析，就是利用生信算法，挑选整个体系中最合适的鱼钩，让鱼钩彼此之间不会有干扰。而实验方法，则是改造鱼钩，将鱼钩改造成不容易互相干扰的样式。如下图，联川生物改良创新的多重PCR技术方法，采用Ω引物结构，提高引物的特异性，减少非特异性扩增。

或者将鱼钩封住，等到需要它的时候，再让它发挥功能，如下图，IDT埃德特的rhAmp PCR技术，
使用带RNA碱基的rhAmp引物对目标区域进行多重PCR扩增
，RNase H2 对 DNA:RNA 杂合双链内的 RNA 碱基进行靶向切割
解除，3' 端封闭序列从而活化rhAmp 引物
。RNase H2 具有高度特异性，只切割完全互补匹配的RNA碱基
，因此减少了非特异性杂交和引物二聚体。

其中，最经典去除二聚体的方法，当然是引物中引入U碱基，扩增后，使用UDG等混酶，消化多余的引物，防止引物二聚体。还有其他很多的技术方法，大部分都是在引物上的修饰或改造。

上面说的技术方法，能够在一定程度上解决引物二聚体的干扰问题。但是很难彻底解决这个问题。因此多重PCR，依然存在重数限制，达到1000重算是很不错了。

在技术应用上，利用多重PCR进行病原菌检测，应该是技术门槛最高的，因为病原菌的含量在患者的组织或体液中有的很低，而且有人源基因组的扩增干扰问题（背景DNA太多），对于多重扩增带来了很大的问题。引物二聚体的问题更是突出。但是多重PCR技术的便捷和低价，是这个技术最大的优点，因此如果能够真的将多重PCR技术的诸多问题解决，在许多方面，可以大规模低成本的使用，如分子遗传育种、疾病诊断、病原体监测和突变识别等方面都可以发挥巨大价值。