基因组结构变异(structural variations, SVs)通常指基因组的序列和位置变化，如＞50 bp的插入或删除(indel)、串联重复(tandem repeat)、染色体倒位(inversion)、染色体内部或染色体之间的易位(translocation)、拷贝数变异(copy number variations, CNVs)及其他形式更为复杂的变异。

由于SVs的断裂点更有可能发生在人类基因组的>98%非外显子区域，因此使用WES数据很难检测到SVs。

读长匹配策略(Read-pair, RP)和读长分割比对策略(Split-read, SR)仅限于ES的读长覆盖区域的断点分析。因此，WES数据主要局限于使用读长深度(Read-depth, RD)策略分析CNVs(缺失和重复)。

然而，WES数据中的RD信号会受到一些因素影响，例如GC含量，因此无法可靠地检测小的CNVs(涉及一个到几个外显子)，如果再加上使用RP和SR分析，小的CNVs能更容易被检测到。

尽管WES分析SVs存在困难，但大约2%~4%的SVs(取决于外显子组试剂盒目标区域的大小)，预计断点会发生在足够靠近目标区域的地方，使其能够被检测到。

6,224例患病个体的WES数据(来自5,825个家庭和3,090名未患病亲属)，均来自“Solve-RD——解决未解决的罕见疾病”研究计划("Solve-RD solving the unsolved rare diseases")，这是欧盟委员会资助的一项为期五年(2018-2022)的研究项目。

使用BWA-MEM 0.7.8软件将Reads与GRCh37 hs37d5人类参考基因组进行比对。

基于读长匹配策略(Read-pair, RP)和读长分割比对策略(Split-read, SR)，利用WES数据，使用Manta SV caller软件，分析SVs。

除了Manta，作者还测试了InDelible，这是一款专门为WES数据开发的用于分析SVs。(虽然在队列中应用indeleble，没有发现额外的SVs)

在6,224例患者中，检出32例(0.51%)有SVs，涉及23个家系的23种不同的SVs(被认为是致病的)。

在这23个SVs中，基于RD策略的CNV分析方法(使用了ClinCNV、ExomeDepth、Conifer)未检出8个(0.13%的受检者)(上图中的绿色部分)。

为了与基于RD的CNV分析方法比较，将识别出的SVs分为三类：

①简单的缺失或重复(CNVs)。15个SVs归类为简单的CNVs，其中5个由于长度太小无法通过CNV方法检测到(涉及单个外显子或单个外显子的一部分，大小范围66~3077个碱基)。在这种情况下，只能依赖基于RP和SR进行CNV分析，因为基于RD分析CNV时，覆盖范围在标准噪声水平之外没有明显变化。

最长的CNV是涉及3077个碱基的缺失(无法通过基于RD分析CNV)，仅涉及SHANK3基因 (NM_001372044.1) 的第23号外显子的36个碱基，该外显子总长度为2.2 kb。

在基于RD的CNV分析中，由于样本中存在过多的候选CNVs，未发现影响隐性基因B4GALNT1的一个简单缺失(9563个碱基缺失)，但是经过优化，减少了CNVs的信号，最终能够被发现。同时也发现了，另一个等位基因上的错义变异，因此构成复合杂合，能够解释患者的表型。

基于RD的CNV分析方法漏掉了70个碱基的简单重复

一个复杂的SV：配对读长的距离表示串联重复的存在。基于RD的CNV分析发现在检测到的重复序列旁边存在一个缺失，两者共同形成一个复杂的SV。

②复杂的SVs(缺失、重复、倒位的组合)，其中一部分可以通过基于RD的CNV分析检测到。在这种情况下，使用ES数据几乎不可能检测到所有断点，但可以提示基因组可能存在复杂的SVs。(上图种橙色部分)

在这种情况，RD策略需要联合RP或SR策略进行分析。

③中性拷贝数变异。检出2例致病性倒位，这两例倒位均发生于表型非常符合的患者。Manta并没有将变异类型报告为INV(倒位)，而是BND(断点)，因此，为了识别倒位，必须可视化地核查所有断点。

第1例：涉及近10Mb的倒位(g:9:130,887,682-140,727,115, hg19)，影响EHMT1基因第25内含子。该患者符合Kleefstra综合征1型(Kleefstra syndrome type 1, KS1)的诊断标准，KS1是一种以精神运动发育迟缓、认知障碍、行为障碍、面部畸形、颅骨形状异常、手异常和先天性心脏缺陷为特征的综合征型神经发育疾病。考虑到提示的异常表型，该患者之前已经使用过阵列比较基因组杂交(aCGH)和EHMT1基因的Sanger测序。由于并没有在候选基因中检测到任何可能的致病性变异，导至患者的诊断延迟了几年，尽管有强烈的临床表型提示。400条带分辨率的核型分析没有该倒位，但通过FISH验证存在倒位。

第2例：倒位片段大小约为180kb，影响DMD基因。

综 上

利用WES数据进行重分析，可以从基于RP或SR的SVs分析方法中获益。

在本研究中，大多数CNVs(65%, 15/23)是可以通过基于RD的CNV分析方法发现的。

分析WES数据时，成功识别SVs的机会与SVs的长度无关，但断点必须在外显子区域，且能被大量的具有异常的方向或插入片段长度(insert size)的读长所覆盖。

在WES数据中检测到的CNVs不能像基于SVs分析法那样提供准确的断点信息，因此，在ES数据中，使用基于RD或SR的SVs分析法可以提供有价值的附加信息。

作者没有对WES中的SVs分析策略的敏感性进行评估，因为敏感性很低。

使用Manta或类似工具进行SVs分析不能取代基于RD的CNV分析，因此只能作为补充手段，仅带来微小的获益。

总的来说，利用WES数据发现基因组结构变异还是相当困难，也需要非常仔细地挖掘数据，也相当“考验”外显子组试剂盒的设计方案，总体上利用WES分析SVs获益较低，但也存在可能性。