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三代基因测序:单分子测序技术,一文了解!

2022-9-28 10:00| 编辑: 归去来兮| 查看: 4144| 评论: 0|来源: 丁香园肿瘤时间 | 作者:王福栋

摘要: 单分子测序技术在其实际临床应用中有待进一步自我提升与完善。


随着分子生物学的快速发展,肿瘤基因及病原微生物基因测序等技术已成为现代临床诊疗的重要辅助手段。

  • 一代基因测序开启了 DNA 测序的序章,但其价格昂贵、测序速度慢限制了其在多样本大规模测序项目上的使用。

  • 二代测序的测序通量高且测序成本较低,但文库构建复杂繁琐、测序读长短、序列分析时间长。

为了更加精确高效地挖掘 DNA 信息,科研人员开发出第三代测序技术,即单分子测序(single molecule sequencing)技术

这项技术与前两代技术不同的是测序时不需要进行 PCR 扩增,而是基于单分子的电信号或化学反应信号检测,实现了对每一条 DNA 分子的单独测序。



单分子测序技术简介

单分子测序技术又称纳米测序技术,纳米孔只允许一条链进入,可根据碱基的荧光或者电流阻断识别碱基序列,包括 PacBio 技术和 Nanopore 技术。

PacBio 技术利用荧光标记不同的碱基与待测序列、DNA 聚合酶一起放入纳米孔底部。每个纳米孔只允许一条 DNA 模板进入,DNA 模板进入后,DNA 聚合酶与模板结合,加入 4 种不同颜色荧光标记的 dNTP,通过荧光信号时间的不同,识别碱基序列。

Nanopore 技术的核心是每个纳米孔结合一个核酸外切酶。当 DNA 模板进入孔道时,核酸外切酶切掉穿过纳米孔道的 DNA 碱基,因此每一个碱基通过纳米孔时都会产生一个阻断,根据阻断电流的变化识别碱基。



单分子测序技术的特点

1、较长的测序读长:单分子测序技术利用碱基穿过纳米孔时电信号的改变实现测序,原则上可检测通过纳米孔的全部核酸序列,因此对测序长度没有限制,目前最长读长可达 2.4 M。

2、可实时测序:测序文库制备过程简单,无需对样品中核酸进行 PCR 扩增或逆转录,可以直接对 DNA 或 RNA 进行测序;可边测序边输出结果,能够实现对测序数据的实时分析。

3、纳米孔测序设备简单便携:目前使用最成熟的 MinION 测序仪可在极地、海洋甚至太空等各种复杂环境下完成实时测序,可保证对突发疫情处理的时效性。

4、可直接对 RNA 进行测序:纳米孔测序可以直接对各类形式的 RNA 进行测序,能避免目前对 RNA 病毒进行测序和研究时必须将 RNA 逆转录为 DNA 扩增所产生的偏向性及可能引入的突变。



单分子测序技术的临床应用

第三代 DNA 测序技术相较于前两代测序技术,具有超长读长运行快、无需模板扩增、直接检测表观修饰位点等特点,主要用于基因组测序、甲基化研究、突变鉴定(SNP 检测)、病原微生物的测序鉴定等方面。此外,单分子测序技术使我们能够识别包括复杂结构变异的癌症突变

在癌症检测方面,单分子测序技术适用于阐明等位基因突变状态和复杂癌症基因组的完整结构,这可能将为我们提供癌症分子分型新标准,指导临床个体化治疗。

在检测大型基因组变异方面,单分子测序技术优势明显。SV 为 > 1 kb 的大型基因组变异,如大片段的插入缺失、倒位和重复,或染色体重排,如易位。

二代测序也可以使用这种分析方法,但大而复杂的 SV 和重复区域的鉴定对短读长来说极为困难。三代测序使我们能够阐明使用传统的二代测序难以鉴定的异常基因组状态。

另外,三代测序技术在癌细胞的全长转录组检测及癌症表观基因组学等领域也有相应应用。



单分子测序技术应用面临的挑战

相比通过二代测序进行癌症基因组测序,三代测序可以收集更全面的癌症基因组信息,但三代测序技术仍然存在一些阻碍其在临床测序中应用的障碍。

  • 首先,在三代测序平台上,目前碱基准确度约为 90%,其准确度有待进一步提升。

  • 其次,并非总是能够从临床样本中获得足够大且完整的高分子量 DNA 和全长 RNA

  • 此外,三代测序技术仍然缺乏针对少量样品的高产量文库制备和测序规范流程

单分子测序技术在其实际临床应用中有待进一步自我提升与完善。

✩ 本文仅供医疗卫生等专业人士参考

策划:王斌儒


参考文献

1. Larkin Joseph, Henley Robert Y, Jadhav Vivek, et al. Length-independent DNA packing into nanopore zero-mode waveguides for low-input DNA sequencing. Nat Nanotechnol, 2017, 12: 1169-1175.

2. Yang Shuaibing, Zhao Qianqian, Tang Lihua, et al. Whole Genome Assembly of Human Papillomavirus by Nanopore Long-Read Sequencing. Front Genet, 2021, 12: 798608.

3. Jain Miten, Koren Sergey, Miga Karen H, et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nat Biotechnol, 2018, 36: 338-345.

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