C反应蛋白与动脉粥样硬化

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C反应蛋白(C-reactiveprotein, CRP，www.okaybio.com/crp/c-reactive-protein/)，一个进化上高度保守的血浆蛋白， 是人类经典的急性期反应物。 一旦人体出现感染、 炎症或组织损伤，其血浆水平可在数小时内上升1000倍以上[1]，这是临床早期非特异性疾病指标。近年来，C反应蛋白表达的另一个方面， 即CRP不仅是动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)风险标识， 而且可能直接参与了AS的病理生理过程[2]，引起了科学界和公众的关注。体外研究显示，CRP能激活补体系统， 引发脂质沉积， 造成内皮功能受损[3]；CRP可通过上调黏附分子和趋化因子的表达，促进内皮细胞炎症的发生[4]；CRP可活化单核-巨噬细胞， 可促进巨噬细胞的吞噬作用， 提高局部细胞吸收氧化型低密脂蛋白(oxidizedlow density lipoprotein, ox-LDL)，进一步形成泡沫细胞[5]；但是在ApoE-/-和ApoB100/100Ldlr-/-小鼠动脉粥样硬化模型中，CRP既无致动脉粥样硬化作用，也无抗动脉粥样硬化作用[6]。对于人CRP在小鼠动脉粥样硬化模型中无作用的原因至今仍不清楚，甚至有些实验证明，CRP具有抗动脉粥样硬化的保护作用。
CRP概况1.1CRP结构、配体和受体人类CRP是古老的、高度保守的五聚体蛋白家族的成员之一，由5个非共价结合的原体对称性地围绕中心孔排列而成(图1)。每个原体由206个氨基酸构成的肽链折叠形成两个反向平行的β折叠和一个扁平卷芯样拓扑结构[7]。CRP分子有两个作用面，识别面有5个依赖Ca2+的磷酸胆碱(phosphorycholine,PCH)结合区，可以与病原体、凋亡坏死细胞膜上的PCH结合识别[8]。CRP除了能与PCH结合，还能与磷酸乙醇胺、 核糖体蛋白颗粒、DNA成分结合[9]。效应面可以与1个C1q结合活化补体经典途径，生成C3转化酶， 也可以与巨噬细胞免疫球蛋白受体(Fcγreceptors, Fcγ-Rs)结合， 调理吞噬作用，其中主要是Fcγ-RIIa(CD32)和Fcγ-RI(CD64)[10]。有学者认为，现今CRP研究结果出现矛盾的原因可能与Fc-Rs兼具有传递活化或抑制信号给效应细胞的功能有关。
1.2CRP的合成CRP在肝细胞合成和分解，其突出生物学特点之一就是，在急性时相期， 如感染、炎症或组织损伤的24~72 h内，血清CRP水平可迅速上升至正常水平的1000倍，之后又可快速地降低至正常水平。CRP表达主要受转录水平的调节，研究表明，IL-6是主要诱导CRP基因表达的细胞因子[11]。但肝外也有CRP的表达， 如神经元细胞、动脉粥样硬化斑块、 单核细胞、 淋巴细胞和脂肪细胞[12-14]。随着人们在动脉粥样硬化斑块区发现CRPmRNA和CRP蛋白的表达，有学者假设这些CRP可能是由血管壁组织局部合成的， 并不是由血液循环中CRP沉积而来的。Calabro等[15]发现用TNF、内毒素或者IL-1与IL-6的复合制剂刺激人冠状动脉，可诱导人冠状动脉平滑肌产生CRP，本结果支持上述假说；但是冠状动脉粥样硬化病损区的CRP到底是血管壁自身合成还是肝源性沉积而来，还有待进一步研究。
2 CRP和动脉粥样硬化发生机制血清 CRP 水平与冠心病的危险因素， 如吸烟、肥胖、 体重指数、BMI、糖尿病、 年龄及血脂之间存在一定的相关性[16-17]。AS病变血管局部的CRP浓度要高于血浆中的CRP水平，且动脉粥样硬化病灶中有大量的CRP配体可以介导CRP的摄取，从早期到晚期动脉粥样硬化病变的病灶中都存在CRP,且随着病变的不同时期CRP的水平发生变化，说明CRP与 AS的发展可能存在密切关联[。
2.1CRP与补体系统在补体系统介导的急性心肌梗塞组织损伤中，CRP是引起补体活化的主要因子，CRP通过激活补体系统，导至不同心梗模型中心梗面积增加[19]。CRP可通过C1q激活经典补体系统形成C3转化酶，及通过调理素补体片段修饰配体表面，但由于C3转化酶表面结合了两个H因子，可抑制替代途径扩增酶和C5转化酶形成， 仅发挥调理素的作用促进吞噬细胞的吞噬。
2.2CRP与血管内皮细胞内皮功能紊乱是动脉粥样硬化早期病理变化，Devaraj等[21]研究发现，CRP可促进内皮微粒及循环中内皮细胞的产生，促进内皮功能紊乱。CRP可促进内皮细胞的炎症反应， 通过表达黏附分子和趋化因子加强白细胞与内皮细胞的反应[4]。CRP可减少内皮型NO合成酶(eNOS)的合成，其机制包括eNOSmRNA稳定性的下降，降低eNOS在1179位Ser的磷酸化，还原型辅酶II(NADPH)氧化酶释放超氧阴离子，eNOS不平衡现象[3]。CRP还可增加LOX-1的表达，加强ox-LDL对内皮细胞功能的损害及增加血管紧张素-II(angiotensin-II)自身致炎症效应[22]。CRP可通过促进凋亡损害原始内皮细胞迁移和黏附能力， 导至原始内皮细胞功能的紊乱[23-24]。另外，Grad等[25]发现内皮细胞局部产生的CRP可通过增加P-选择素(P-selectin)的产生促进血小板黏附致血栓的形成。Guo等[26]用低浓度CRP模拟牙周炎慢性炎症环境，发现在人脐静脉内皮细胞中CRP抑制其增殖促进细胞凋亡及单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)的产生。
2.3CRP与巨噬细胞CRP通过Fcγ受体与巨噬细胞结合活化巨噬细胞。CRP与巨噬细胞结合，可提高局部细胞吸收ox-LDL，进一步形成泡沫细胞，且可抑制胆固醇从人巨噬细胞源性泡沫细胞中外流[4]。Devaraj等[27]研究发现，CRP可上调人动脉内皮细胞及人单核细胞源性巨噬细胞释放集落刺激因子(M-CSF)，促进巨噬细胞的增殖，其机制可能与核因子-κB(NF-κB)活化有关。Maingrette等[28]发现，CRP可促进巨噬细胞对脂蛋白脂肪酶的表达，脂蛋白脂肪酶是2型糖尿病患者中致动脉粥样硬化的关键分子，这一效应可被抗氧化剂、 蛋白激酶C (PKC)、MAPK及AP-1抑制剂等拮抗。Meng等[29]用不同浓度的人重组CRP与THP-1单核细胞培养24h后， 发现CRP浓度越高对单核细胞的趋化作用越大，其机制可能与增加单核细胞CC趋化因子受体的表达有关。Zhao等[30]研究发现，CRP可增加巨噬细胞产生释放可溶性血凝集素性氧化型低密度脂蛋白受体-1(solublelectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,sLOX-1)，sLOX-1在动脉粥样硬化巨噬细胞泡沫化中起着关键性作用，其机制可能是CRP与FcγRII受体介导P47磷酸化，氧自由基产生及肿瘤坏死因子-α转化酶(tumor necrosis factor-α converting enzyme,TACE)活化有关。CRP除了能与凝集素样氧化性低密度脂蛋白受体(LOX-1)识别之外还能与另一种清道夫受体SR-A识别介导巨噬细胞的吞噬作用。
2.4CRP与中性粒细胞CRP对中性粒细胞是负性调节作用，CRP可抑制中性粒细胞PMH诱导超氧化物的形成及颗粒的分泌，降低细胞内蛋白的磷酸化[32]。CRP阻止IL-8、FMLP、C5对中性粒细胞的趋化作用，降低了P38激酶的活性。CRP可裂解和封闭中性粒细胞表面的L-选择素使其与内皮细胞的黏附能力和组织迁移能力降低[33]。CRP可封闭其表面的IL-6受体，影响IL-6对中性粒细胞的作用。
自从CRP被认为在动脉粥样硬化中起着关键性的作用之后，学者对其作了多方面的研究：动物模型注射外源性人CRP；转基因小鼠过表达人CRP；体外细胞培养实验。但是对于CRP与AS之间作用的分子机制仍不清楚， 且实验结果存在许多矛盾。Tennent等[35]实验表明， 转基因ApoE-/-小鼠中CRP的表达不影响动脉粥样硬化的形成。ApoB100/100Ldlr-/-动脉硬化小鼠模型中，CRP可延缓AS的形成。通过基因打靶的方法产生了CRP缺陷小鼠，并将灭活的等位基因引入到动脉粥样硬化易感性ApoE -/-小鼠和Ldlr-/-小鼠中发现，C反应蛋白缺陷模型的动脉粥样硬化斑块形态分析显示动脉粥样硬化病变与对照组相等或略有增加[36]。实验结果不支持C反应蛋白的致动脉粥样硬化作用。事实上，小鼠CRP甚至可能介导动脉保护作用。
前述矛盾无法简单地归因于实验体系差异或外源污染(如内毒素叠氮化物[37])；相反，某种活性显著增强的 CRP变体形式的存在与否及水平高低或许是更合理的解释。 于是人们发现CRP的另一种分子结构。人正常的CRP为天然五聚体结构(pCRP)，而在动脉粥样硬化区域存在单体结构形式(mCRP)，推测CRP不同的结构会有不同生物学效应， 导至AS实验结果的不一致。mCRP可能才是AS关键分子。
3 mCRP概况3.1mCRP结构、配体与受体CRP失去五聚体结构， 通过变构重排形成mCRP，可认为是单体CRP或者是修饰后的CRP。现已发现mCRP存在于正常血管组织、动脉粥样硬化区域、损伤的脑组织、 肾脏以及其他炎症组织中[38]。mCRP受体与CRP受体不同， 是另一种免疫球蛋白Fcγ-RIII(CD16)。但实验证明，抗-Fcγ-RIII(CD16)抗体只能终止一小部分mCRP的作用，提示mCRP可能存在其他的细胞受体。2007年，Ji等[39]研究发现，mCRP与人主动脉和冠状动脉内皮细胞作用是通过插入细胞膜， 与细胞膜上脂筏结合而不是与膜表面Fcγ-Rs或蛋白多糖结合。mCRP与膜结合主要取决于膜胆固醇含量，推测可能与CRP胆固醇结合序列(aa35~47)和羧基末端八面肽(aa199~206)有关。若用甲基-β-环糊精或制霉菌素分解脂筏，则可抑制mCRP所致的细胞因子的释放，反应性氧基的生成及黏附分子在内皮的表达。
3.2mCRP的合成与人天然五聚体CRP(pCRP或nCRP)不同的是，在血液循环中并不能检测出mCRP，推测它只能与组织结合，在局部由pCRP变构重排而产生。现今存在4种在体外产生mCRP的方法：(1)通过尿素螯合和加热的方法使CRP蛋白变性成为mCRP，其与原来的CRP相比较，二级结构由原来的β-折叠成为α-螺旋[40]；(2)基因突变方法重组人mCRP蛋白，CRP蛋白中氨基酸Cys被Ala取代，重组合成rmCRP[41]；(3)当CRP保存在无Ca2+的溶液中时会自发产生mCRP，且在无Ca2+条件下，CRP与mCRP都易被蛋白水解[42]；(4)在生理状态下，当CRP与细胞膜或脂质小体结合时， 或者与活化的血小板接触时， 可产生mCRP，这也可能是体内生理条件下mCRP产生的原因。
mCRP与动脉粥样硬化发生机制
4.1mCRP与补体系统使用结构特异性抗体发现在人冠状动脉硬化区内膜只有mCRP沉积，并无pCRP，在健康人群的血管内膜则两者均无。有学者推测mCRP才是致动脉粥样硬化作用的主要效应分子， 但是mCRP与AS分子机制研究并不多。Mihlan等[43]发现，CRP对补体系统的调节效应主要是由mCRP而不是pCRP产生。mCRP可募集补体抑制因子H至损伤细胞区或颗粒区，mCRP可加强液相和细胞表面补体抑制作用。mCRP通过C1q可激活补体，形成C3转化酶和C3b表面沉积，但与H因子结合后，补体系统的进一步活化、 增殖、 细胞因子释放、终端膜攻击复合物形成均被抑制。
4.2mCRP与血管内皮细胞Khreiss等[44]研究pCRP与mCRP对内皮功能的影响，发现人冠状动脉内皮细胞与mCRP一起培养4h，就可引起细胞因子MCP-1、IL-8、 ICAM-1、E-选择素及VCAM-1蛋白表达，以及mRNA量显著上升，且不需要血清的参与；而与pCRP培养4 h内并不能引起细胞因子的分泌，24h后才会表达，推测在这一段时间内CRP可能自然分解变构成mCRP。mCRP可能通过磷酸化激活p38-MAPK途径促进内皮细胞的炎症表现。Singh等[45]用mCRP作用于人脐静脉内皮细胞发现可减少其对乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)的吸收。mCRP与酶修饰的低密度脂蛋白(E-LDL)，其结合潜力是pCRP的60倍。Ahrens等[46]发现pCRP与mCRP对内皮祖细胞功能及分化具有相反的调节效应。
4.3mCRP与巨噬细胞、中性粒细胞mCRP可促进吞噬细胞对凋亡颗粒的吞噬， 抑制细胞因子TNF-α、IL-8释放。mCRP与E-LDL结合可减少巨噬细胞对ox-LDL的吞噬作用，可能通过降低巨噬细胞对ox-LDL反应性， 抑制泡沫细胞的形成，而具有抗动脉粥样硬化的保护作用[47]。Khreiss等[48]发现，mCRP具有抗中性粒细胞凋亡作用，主要由Fcγ-RIIIb(CD16)受体介导。mCRP与pCRP对中性粒细胞的作用相反，可上调中性粒细胞表面黏附分子CD11b/CD18的表达，增加中性粒细胞与内皮细胞的黏附能力。mCRP可通过过氧硝酸盐途径活化NF-κB和活化蛋白-1促进人中性粒细胞IL-8的释放。
5理性看待CRP炎症在动脉粥样硬化性疾病发生、 发展中扮演重要角色，CRP是重要的炎症标志物。应用抗炎治疗，降低血中 hsCRP 浓度，可有效地控制冠心病的发生及发展过程， 减少心血管事件发生。 他汀类药物治疗可产生包括抗炎的非调脂保护作用，减少冠心病病死率[50]；但是有学者根据一些亚组分析认为，他汀类药物的心血管保护作用受CRP水平影响。对于CRP升高的患者，他汀类药物的作用更大，而对于较低的CRP和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平的患者来说，他汀治疗未必有效。 实际上其疗效评估和预后价值仍需进一步探索， 到底CRP在动脉粥样硬化性疾病发生过程中起什么作用；检测CRP对于预测心血管疾病风险、他汀类药物的疗效以及细化他汀类药物适用人群有什么作用等都需要进一步的研究， 提供更多可靠的证据及更好地指导临床实践。当前应该理性对待CRP的临床应用，对于冠心病患者来说，LDL-C仍是当前最简单易行且证据充分的干预指标。
6展望对CRP的深入研究，不仅可以使我们更好地认识冠心病动脉粥样硬化， 将有可能帮助人们找到治疗心血管疾病和动脉粥样硬化的有效方法。CRP、mCRP与AS之间的分子机制是目前研究热点之一，尤其在CRP缺陷小鼠研究发现并不减少AS的发生后，对于CRP到底是AS预后因子还是干预因子产生质疑，mCRP可能才是pCRP发挥致动脉粥样硬化作用形式，调控局部炎症过程的主要CRP异构体。今后研究可从以下几方面入手：(1)探明mCRP受体：mCRP受体至今仍不完全清楚，膜上脂筏可能是mCRP膜上作用的受体的发现，为CRP受体及其分子信号转导通路的研究提供了新思路；(2)对于mCRP研究多用尿素处理CRP或者初级结构突变所得，但是通过CRP自然分解所产生的mCRP生物学活性的研究很少，对于mCRP产生机制及其与AS的关系，值得进一步研究和观察。