IVD产品经理系列-生化知识细说之验证与评价

纳兰烙烙

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生化试剂参考方法及物质

临床生化检验方法分级

决定性方法：是指准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法。

参考方法：是指准确度与精密度已经充分证实的分析方法，干扰因素少，系统误差与重复测定的随机误差相比可以忽略不计，有适当的灵敏度、特异性及较宽的分析范围。

常规方法：是指准确度与精密度已经充分证实的分析方法，干扰因素少，系统误差与重复测定的随机误差相比可以忽略不计，有适当的灵敏度、特异性及较宽的分析范围。

决定性方法（definitive method）也称为一级参考方法（primary reference method)，

参考方法（reference method）也称为二级参考方法（secondary reference method） ，

常规方法（routine method）也成为推荐方法（recommended method） 。

临床生化检验的参考物质和校准品

原级参考物质：（primary reference materials）也称一级标准品，与决定性方法平行，用于验证决定性方法、评价与校准参考方法，以及为二级标准品定值。

次级参考物质：（secondary reference materials）也称二级标准品 ，二级标准品的定值源于一级标准品和参考方法，主要用于评价常规方法，也可为质控物定值。

常规校准品：校准（calibration）指的是对由仪器、方法和试剂所组成的检测系统的校准过程。

电解质、酶类、其他生化指标应合理选择校准品。

大多数定量的方法（分光光度法、电化学、免疫定量）都需要用标准品校准，即通过标准比较来计算。校准是这些方法定量必经的过程。

用什么“标准”来校准？

罗氏公司的C.f.a.s （calibrator for automation system），属于多项校准品，因使用方便，很多实验室都在使用。但前提是“指定的测定系统”

溯源性(traceability）是指通过一条具有规定不确定度（uncertainty）的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准（通常是国家或国际测量标准）联系起来的特性，称为溯源性。其不间断的比较链称为溯源链。

测量不确定度是指表征合理地赋予被测之值的分散性。是与测量结果相联系的参数，可理解为排除系统误差之外的所有随机误差的合成方差。

（一）检测系统的概念

完成一个项目检验所涉及的仪器、试剂、校准品、质控品、操作程序、质量控制、保养计划等的组合称为检测系统（testing system）。常规检测系统有配套检测系统和自建检测系统。

（二）检测系统的分类

配套监测系统：

整个检测系统涉及的各个部分完全按照指定厂商要求配套使用。若该系统已经国家法定部门认证,则使用这样的检测系统对临床样品进行检验，其结果具溯源性。

自建检测系统：

实验室自行建立的检测系统，如A制造商的试剂盒、B制造商的校准品、C制造商分析仪的组合。

方法学性能评价内容

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统一方法：以方法学评价为基础，提出参考方法或推荐方法。统一试剂的主要成分和测定条件。实施机构：国际临床化学学会、临检中心。

逐级溯源：常规校准品应向二级标准品、一级标准溯源。实施机构：ISO、国家标准计量局、参考实验室、试剂盒供应商、临床实验室。

保证仪器良好的工作状态、严格的操作规程和质量控制、实验室内部测定系统的比对、实验室间的比对。

（一）重复性试验

1.试验样品 一般选择2个，一个在参考区间附近，另一个为异常值

2.初步的批内精密度评价：即一个样品重复测定20次，计算出均值，标准差和变异系数。

用2个样品每天测定2批，批间测定间隔不得少于2h，每批平行测定2份，至少共测定20天，80个数据。每对结果间的差（共40个）代表批内差；2批均值之间的差（共20个）代表批间差；每天4个结果的均值（共20个）代表日间差。每批测定至少做一个质控。

（二）回收试验

所谓回收即评定方法正确测定加入常规样品中的纯分析物的能力。即在未知浓度的常规样品中加入一定量的待测组分，检测加入前后该组分的增加量，实际增加量与理论加入量的比值就是回收率。目的是测定比例系统误差 。

（三）干扰试验

干扰是指在测定某分析物时，受其他非分析物的影响而导至测定结果增高（正干扰）或降低（负干扰）。根据干扰的产生原因分为：基质效应、非特异反应、外部干扰物等。

干扰试验的设计同回收试验，即将不同浓度的干扰物代替纯标准品。一般规定只对胆红素、血红蛋白、脂类做干扰试验。

干扰值＝加入干扰物后的测定值－基础测定值。

（四）线性试验

线性试验用来评价剂量和反应之间的线性关系，并把呈直线部分确定为线性范围（linear range）。线性范围指检测信号与被测物浓度呈线性时的被测物浓度范围。

1.样品浓度 线性评价至少应有5个不同浓度，可选择低值和高值样品各一份，低值样品和高值样品分别按体积3：1混匀、等份混匀、1:3 混匀，形成5个不同浓度。

2..试验方法 将不同浓度的样品（X），随机排列，每个样品重复测定4次（Y），并要求在当天完成所有分析

（五）对比试验

对比试验是指分别用两种方法测定一组临床不同浓度和病理情况的样品，测定结果进行回归分析。

比较方法应选择参考方法或公认的常规方法，测定偏差主要来源于评价方法。

1.试验样品 应收集新鲜的正常和异常的临床样品，应有足够宽的浓度范围，各浓度样品数量应有合适的比例。

2．样品测定 样品数至少为40个，每个样品用2种方法分别作双份测定。每天测定8个样品，双份测定时第一次按顺序1，2……7，8，第二次8，7……2，1，共测试5天

（六）检测限

检测低限通常是指能与适当的“空白”读数相区别的待测物的最小量。方法是做空白平行试验（一般20次），以蒸馏水调零，读取各次吸光度，计算均值（Ab）和标准差(S)。以Ab+3S表示与“空白”读数相区别的最小吸光度，将其换算成浓度，作为该法的检测低限。

临床实验室以生物检测限更为重要，需采用接近检测低限的生物检测限样品来确定，能更真实地反映实际检测限水平样品测定的不确定度。

临床生化试剂盒的分类

单液体型：单液体型特别适用于半自动生化分析仪和小型自动生化分析仪。

稳定性较差。

液体双试剂：

1.稳定性能好

2.可消除样品自身空白

3.提高抗干扰能力

4．预反应

多项同测组合试剂 浓缩试剂

（一）试剂空白吸光度

用蒸馏水做空白，用指定的空白液加入试剂作为样品测试，在测试主波长下，记录测试启动时的吸光度（A1）和约5分钟后的吸光度（A2），A2测试结果即为试剂空白吸光度测定值。

是判定试剂质量的一个有效指标

• 双缩脲法测定总蛋白
• BCG法测定清蛋白
• 改良赖氏法测定ALT
• NADH底物
• 色素原底物
  
  

（二）试剂空白变化速率

对于速率法试剂盒，用指定的空白液加入试剂作为样品测试时，在测试主波长下，记录测试启动时的吸光度（A1）和约5分钟(T)后的吸光度（A2），计算试剂空白吸光度变化率（DA/min）。

测定试剂空白吸光度变化（ΔA/min），用来检查试剂在工作状态下的稳定性。但事实上，试剂空白吸光度变化速率无法反映试剂盒的稳定性，试剂空白吸光度变化速率主要反映干扰程度和仪器的稳定性。

（三）分析灵敏度

用吸光度差值（ΔA）或吸光度变化（ΔA/min）来表示单位浓度的被测物反应所引起的信号变化，其含义类似摩尔消光系数。

分析灵敏度不是越高越好，以适合待测物检测范围为原则。

分析灵敏度一般用于批间比较，较能反映制造商的配方、原料的一致性。

（四）线性范围

取高浓度样品和低浓度样品按不同比例混合成5个浓度做线性试验。

试剂（盒）的线性范围越宽，临床复测几率越小，但与样品/试剂比例成反比。

（五）重复性

1.批内重复性 在重复性条件下，用高、中、低三个水平浓度（高、低浓度应超过参考区间20%～30%，中浓度水平在参考区间之内）的控制血清或新鲜人血清测试试剂，重复测试至少10次。

2.批间重复性 用质量控制血清测试3×3（3个批号，每个批号取3瓶）批间差，较能反映制造商的配方、原料的一致性。干粉或冻干试剂还需测定批内瓶间差，测定同一批号的试剂20瓶，用变异系数（CV）来表示。

（六）准确度

1.相对偏差 直接用试剂盒测定参考物质（平行3次），评价测定均值与靶值的偏离程度。也可用由参考方法定值的高、中、低三个浓度的人混合血清，用试剂盒平行测定3次，计算均值与定值的相对偏差。

2.比对试验 既无参考物质、参考血清，也无标准品，也可用比对试验来验证准确度。

（七）稳定性

1.效期稳定性 取已到效期的试剂盒按以上评价方法对试剂盒性能指标进行评价。可作为审批的依据，但对该批次的试剂盒的稳定性意义不大。

2.热稳定性试验 对同批次试剂盒稳定性目前没有很好的评价方法。生化试剂盒一般置2-8℃保存，为了快速有效地评价试剂盒的稳定性，可以用加速试验来估计。

3.开瓶稳定性 也称在仓稳定性，是指试剂盒置分析仪试剂仓在使用过程中的稳定性。

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生化检验的验证

我国的《医疗机构临床实验室管理办法》和国际标准化组织针对医学实验室颁布的ISOl5189一医学实验室质量和能力认可准则的国际标准中都要求，设备在临床应用之前必须要进行性能验证，以确定设备能达到所要求的性能指标。

设备的性能是否合格，对检验的结果起决定性的作用。

性能评价

自行研究或开发了一个检测方法，为了使方法的检测结果符合临床要求，必须对方法的性能作详细而全面的实验，这时的实验是对性能的评价。

通常是生产厂家完成

性能验证

对他人或厂商的评价资料中的几个主要性能的证实。

实验室自己完成

对配套系统（什么是配套系统），一般验证下列指标：

―准确度(accuracy)---EP-15

―精密度(precision)---EP-5

―可报范围(reportable range)---EP-6

―参考区间(reference interval)---C28-A2

对非配套系统，验证更为广泛。

分析灵敏度评价实验EP17-A

1.分析灵敏度

检测系统或方法可检测的最低分析物浓度为分析灵敏度或称检测限。

检测低限（lower limit of detection,LLD)生物检测限（biologic limit of detection,BLD）功能灵敏度（functional sensitivity,FS）

2.检测低限

样品单次检测可以达到的非空白检测响应量对应的分析物量。用生理盐水、蒸馏水或“0”浓度校准品至少10次；计算均值、标准差；2倍标准差即为检测低限或最低检测限。

3.生物检测限

某样品单次检测可能具有的最小响应量刚大于空白检测低限响应量，该样品内含有的分析浓度或其他量值为生物检测限。配置比检测低限高1-5倍的系列浓度标本，至少检测10次，计算均值、标准差；-2倍标准差的检测响应量都比空白的检测响应量大时的均值即为生物检测低限。

4.功能灵敏度

以天间（至少10天）重复CV为20%时对应检测限样品具有的平均浓度确定为检测系统或方法可定量报告分析物的最低浓度或其他量值的限值。配置比生物检测线高1~10倍的系列浓度，连续检测10天，计算CV。选择最接近20%CV的对应浓度即为功能灵敏度。

分析干扰

为临床生化检验结果中研究、鉴别和确定干扰物质效应提供信息、指导和实验程序。

干扰筛选：

将阳性干扰物（纯的高浓度的胆红素、乳糜、Hb）添加入测定样品中，与不加的对照组比较有无偏倚，称为“配对差异”实验。

如果存在干扰现象，进一步评价以确定干扰物浓度与干扰程度间的关系，这类实验称为

“剂量效应”（dose－response）实验

提高医学诊断率的方法

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方法/系统首次在实验室使用；

EQA/PT 结果未通过，采取纠正措施后；

达到文件规定周期

实验条件

仪器的维护保养

仪器校准

室内质控

试剂、校准品（有效期、批号等）

人员（SOP）

（仪器的最佳状态）

验证内容

―准确度(accuracy)---EP-15

―精密度(precision)---EP-5

―可报范围(reportable range)---EP-6

―参考区间(reference interval)---C28-A2

可报告范围（Reportable Range）：实验室可建立或验证仪器或检测系统测量相应的准确度实验结果值的范围。（CLIA）

文件依据

CLSI 颁布的EP6-A文件《定量测量方法的线性评价》

仪器

应有较好的测定精密度及不存在明显的携带污染等。对仪器应进行定期维护及校准，保证其处于正常状态。

试剂

应注意试剂有效期及批号，不可采用过期试剂或不同批号的试剂。

校准品

可采用与评价试剂配套的校准品。校准品的使用应严格按照产品说明，仪器校准步骤与间隔应按照本室的标准操作程序进行。

样品类型

为避免基质效应对结果的影响，选用的样品应与临床实验样品相似，但不可采用含有对测定方法具有明确干扰作用物质的样品，如溶血、脂血、黄疸或含有某些特定药物的样品。样品物浓度应包括试剂厂商提供的试剂所能达到的线性范围。

样品测定

在进行线性范围确立时，应进行7-11个浓度水平的样品测定，每个样品重复测定2-4次。进行可报告范围验证时，应进行5个浓度水平的样品测定，每个样品重复测定2次。如果测定方法本身存在明显的携带污染，应根据实际情况采取恰当措施尽量避免对测定结果的影响。

结果分析

1、以预期值为横坐标，以实测值为纵坐标进行线性回归，得到直线回归方程Y＝aX+ b ， a在0.97～1.03范围内，r2＞0.95 ；

2、偏倚在允许误差范围之内。

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生化试剂各机型参数确定（节选）

项目名称(test name)：

常以项目的英文缩写来设置。

方法类型(assay/Method )（适用于仪器的方法）：

方法类型主要分为：终点法和动力学法

终点法

一点终点法：样本与试剂混匀一定时间后读取反应终点吸光度，如血糖氧化酶法、总蛋白双缩脲法、白蛋白溴甲酚绿法等。

两点终点法：（又称固定时间法）样本与试剂混匀一定时间后先读取吸光度A1，延迟一定时间后读取吸光度A2，计算吸光度差值与标准比较求得结果。如肌酐苦味酸法等。可消除内源性物质干扰。

动力学法

一级动力学法：（两点速率法）样本与试剂反应不断消耗反应物，反应速度不断减小，吸光度变化不断减小，在特定时间段内进行监测，该时间段内吸光度升高或降低与样本浓度成正比，如同型半胱氨酸、总胆汁酸等。

零级动力学法：（连续监测法，用于酶活性监测）样本与试剂反应，反应物可匀速生成某个产物，如NADH，在特定波长下吸光度均匀的增大或减小，增大或减小的速度与样本浓度呈正比。如碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶等

反应方向(response direction)

正向反应（UP/INC/+）：吸光度增加。

负向反应（DOWN/DEC/-）：吸光度下降。

测定温度

30℃、37℃、25℃

样本体积（sample volum）

一般为2-35μl ，以0.1μl步进。

试剂量（regengt volum）

一般为20-300μl ，以1μl步进。

不同机型生化分析仪的样本量及试剂量限制不同，样本与试剂可根据比例进行增大或减少。

测定波长（wavelength）：

不同生化分析仪具备不同的波长。可选择单波长或双波长。

主波长（main wavelength/primary wavelength ）

根据待测物质在特定波长下具有最大吸收峰来选择主波长。

副波长（次波长sub wavelength/second wavelength ）

可不选择设定。副波长可消除样本溶血，血清浑浊的干扰影响，副波长与主波长越接近越好。

检测时吸光度值为主波长的吸光度减去副波长的吸光度。

分析时间：

孵育时间（incubate time）

一点终点法的孵育时间是指样本与试剂开始到反应终点的时间；两点终点法是指第一个吸光度反应点开始到第二个吸光度点为止时间。一般为5min。

延迟时间（delay time）

加入第二反应试剂后到第一个吸光度监测点开始的时间。即样本与反应试剂（第二试剂）混匀开始至第一个吸光度选择点之间的时间。单试剂一般设置为30s，双底物反应或酶类反应一般设置为1-3min。

连续监测时间（ continuous monitoring time）

在延迟时间后的零级反应开始，监测至少4个点（3个吸光度变化值），一般为1-2min。

试剂吸光度上限、下限/试剂吸光度界限(OD Limt) 底物耗尽限额(substrate exhaust limit)

试剂吸光度线性范围(Linearity）

试剂线性范围（Technical Limit）

前区检查限(Prozone Check Limt)

方程式（Fomular）

小数位（Decimal Places）

双份界限（Duplicate Limit）

敏感性界限(Sensitivity Limit)

第一标准吸光度界限(S1 Abs.limt)

反应过程吸光度界限(Absorbance Limit)