免疫印迹（Western Blot） 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE 可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的 NC 膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如 5%BSA 或脱脂奶粉溶液）处理，封闭 NC 膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体（一抗）处理 NC 膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的 NC 膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG 的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。
使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。
1. Western blot 结果中的背景为什么较高? 可能的原因及建议 1) 膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。Abcam 推荐 5% 脱脂奶粉、3% BSA 或血清封闭 30 分钟。这些可以包含在抗体缓冲液中。 2) 一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。 3) 一抗孵育的温度偏高——建议 4℃结合过夜。 4) 膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。 5) 检测时曝光时间过长——减少曝光时间。 6) 二抗与封闭剂非特异性结合或反应——设置二抗对照(不加一抗)。 7) 一抗或二抗与封闭剂有交叉反应——在孵育和洗涤液中加入温和去污剂如吐温 -20。脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生 高背景。使用 BSA 代替奶粉作为封闭剂。 8) 未结合蛋白质洗涤不充分——增加洗涤次数。 9) 膜的选择导至的高背景——NC 膜比 PVDF 膜背景低。 2. Western blot 结果中杂带较多可能的原因及建议
可能的原因及建议 1) 检测样本不表达目的蛋白——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。 2) 检测样本低表达目的蛋白——提高上样量，不 低于20-30ug，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。 3) 转移不完全或过转移——可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。 4) 抗体不能识别测试种属的相关蛋白——购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。 5) 一抗孵育时间不足或一抗不足或一抗失效——建议 4℃结合过夜，使用高浓度抗体，使用新鲜抗体，重复使用有效浓度会降低。 6) 二抗与一抗不匹配——选择针对一抗来源的种属的抗体。 7) 洗膜过度——洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用 0.1%的弱去垢剂 Tween-20。 8) 封闭剂和一抗或二抗有交叉反应——使用使用温和的去污剂如吐温-20，或更换封闭剂（常用的脱脂奶粉、BSA、血清或明胶）。 9) 二抗受叠氮钠抑制——避免叠氮钠和 HRP 标记抗体一起使用。 3. 其它现象：1) 膜上多处出现黑点或黑斑——抗体与封闭试剂发生非特异性的结合，过滤封闭剂。 2) 反白（条带显白色）——目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高，稀释抗体的浓度。 3) 蛋白分子量偏低或偏高——胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。 4) 分子量蛋白标准条带呈黑色——抗体和分子量蛋白标准发生了反应，在分子量蛋白标准和第一个样品之间增加一个空白条带。 5) 目的条带染色过低/过高——分离不彻底，改变凝胶比例：分子量大的蛋白用低浓度胶，分子量小的蛋白用高浓度胶。 6) 相同的蛋白杂交出现大小不均匀条带——制备凝胶时凝胶凝固太快，致使泳道中丙烯酰胺的比例不均匀，参照凝胶的配方，在凝胶中加入适量 TEMED，放置时在凝胶顶部加入适量 0.1% SDS（水稀释）以防凝胶变干。 4. “微笑”条带1) 迁移速度过快——降低电泳电压。 2) 电泳温度过高（改变了 pH 值和迁移速度）——降低迁移速度或低温电泳(冷库或冰上)。 5. 凝胶染色不均匀1) 细菌污染——4°C 保存抗体并使用新鲜的缓冲液浸泡凝胶。 2) 抗体量不足——确保在振荡孵育时抗体充分浸没膜。 6. TBS 与 PBS 的区别PBS 的缓冲能力强于 TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS 在 PH7.0 以下缓冲能力较弱（不过 PBS 易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选 TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选 PBS。 Western blot 中使用 TBS 和 PBS 均可，只是要根据需要选择合适的浓度。 7. Western 是否可以同时加两种或者多种一抗通常情况下只加一种一抗。做 Western 在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL 显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL 显色、压片、洗片。 8. PVDF 与 NC 膜的区别PVDF 膜价格较贵，可重复使用，但结合能力较强。 NC 膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性较 PVDF 膜差，韧性也不如 PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。 9. Western 一抗的选用 理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。 10. Western 抗体和 ELISA 抗体的区别一般来说用于 western 的抗体主要识别氨基酸序列特异性；而可用于 ELISA 的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。 11. “短路”现象的产生和处理如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层虑纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的，最后结束时一般是开始的 1.5-3 倍都是正常的。一般 Buffer 和滤纸选的对就不会短路。 12. Western Blot 的染色1) 阴离子染料是较常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到 1.5μg，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红 S 和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。 2) 胶体金，灵敏度高，检测范围可到 pg 级，但染色比稳定。 3) 生物素化灵敏度位于 1、2 之间，可用于任何一种膜。 13. 大分子量蛋白转移效率低的解决方法可以在转移缓冲液中加入 20%甲醇（是指终浓度），因为甲醇能增加蛋白质和 NC 膜的结合能力，同时可以延长高分子量蛋白质转移时间；转移缓冲液加入终浓度 0.1% SDS，也是为了增加转移效率；选用优质的转移膜，或使用小孔径的 NC 膜（0.2 微米）；使用戊二醛交联。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。 14. DAB 显色、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理DAB 显色在辣根过氧化酶的作用下能形成一种灰褐色的产物，该产物难溶于醇和其他有机溶剂，DAB 的氧化还能引起聚合作用，导至与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色中，酶将奈酚磷酸（底物）水解成酚类和磷酸。酚和无色的重氮盐（显色原）结合而产生有色的、不溶性偶氮染料。 15. 酶显色与荧光显色的优缺点免疫酶技术就是用酶标记已知抗体（或抗原），然后与组织标本在一定条件下反应并结合，结合形成的复合物中所含有的酶分子遇到底物时，会催化底物水解、氧化或还原，从而发生显色反应。免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术，前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上，形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应，称为非标记抗体酶技术。 免疫荧光技术中的荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清，但免疫酶技术则能克服上述不足，标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法。酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进行免疫电镜观察。 16. 为什么蛋白质印迹条带大小与预期的不同？蛋白质印迹是一种基于蛋白质大小来分离蛋白质的技术。一般来讲，蛋白质越小，在胶上的迁移速度越快。但迁移速度也受其它因素的影响，因此，观察到的实际条带大小可能与预测的不同。常见的因素包括： 1) 翻译后修饰 - 例如磷酸化、糖基化等，可增加蛋白质大小。 2) 翻译后切割 - 例如，许多蛋白先被合成为前蛋白，然后被切割产生活性形式，例如前半胱天冬酶。 3) 剪接变体和异形体 - 可变剪接和异形体可能从同一基因产生不同大小的蛋白质。 4) 相对电荷-氨基酸（带电和不带电）多聚体组分，例如蛋白质的二聚化。这种情况通常在还原条件下需要防止，但强相互作用会导至较大的条带出现。 17. 应该上样多少样品？细胞裂解物、膜裂解物和核裂解物：每孔上样 20 至 30 μg 总蛋白。 这可能需要根据测试样品中的蛋白质表达水平进行一些优化。纯化蛋白（重组或内源）：上样 10 至 100 ng 蛋白。 18. 检测重组蛋白时难以获得条带。为什么？抗体检测重组蛋白质时，存在难以克服的困难，有必要加以考虑。我们推荐确保样品中表达的重组蛋白包含所用抗体的免疫原序列。 同时，如果重组蛋白带有标签，标签可能阻止抗体接近表位。尽可能让标签位于重组蛋白的 C 或 N 末端，以降低这种情况发生的可能性（而不是位于蛋白质的阅读框中间）。 在蛋白质印迹中检测重组蛋白时，我们始终推荐运行内源阳性对照。 19. 样品需要还原和变性吗？我们推荐查看数据表获取更多详情。Abcam 抗体将仅在还原和变性条件下进行测试，除非数据表中另有说明，我们推荐使用还原和变性条件。 在一些情况下，Abcam 抗体也将在非还原条件下进行测试，在这种情况下，我们将在数据表上详细说明（参见应用备注部分或 Abreviews）。如果我们有表明抗体在某种或其它条件下无效的数据，数据表会加以说明。 20. 牛奶和 BSA 封闭有区别吗？抗体可能对封闭剂敏感，我们推荐查看数据表确定是否有数据表明抗体在 BSA 还是牛奶中效果更好。如果有，Abcam 将在数据表中加以说明。 一般来讲，BSA 会产生更清晰的结果，因为 BSA 含有较少的蛋白，因而抗体较少与其发生交叉反应。但并非总是如此，有些抗体在牛奶中的效果更好，因为牛奶含有更多种类的封闭蛋白，能封闭更多不同类型的蛋白质。 21. 能否用室温下孵育一抗 1 小时代替 4 ℃ 过夜孵育？蛋白质印迹中一抗孵育时间需要最终用户进行优化。一般来讲，4 ℃ 过夜孵育将产生更高效、更特异的染色。但许多抗体在室温下孵育 1 或 2 小时效果也非常好。 我们推荐查看数据表上关于合适孵育时间的数据（参见可用的Abreviews、出版物和图像数据）。 22. WB不建议分装抗体，可能会导至抗体失效； 四、参考来源： 1. http://www.detaibio.com/material-western-blot-faq.html 2. https://www.abcam.cn/products?keywords=westernblot |
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