厉害了，成本仅为WGBS一半！牛津大学成功开发新型DNA甲基化测序方法

DNA甲基化有足够的潜力作为癌症的生物标志物，用于筛查、预后以及疗效监测。在表观遗传中，最常见的甲基化修饰就是胞嘧啶甲基化和羟甲基化，产生5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）。已有研究表明，异常的5mC和5hmC模式是癌症的典型特征。【更多DNA甲基化测序信息参见测序中国《2019 DNA甲基化与癌症早筛专题报告》，详情见文末】

目前，亚硫酸氢盐测序是DNA甲基化检测的金标准。几十年来，生物学家多是依靠亚硫酸氢盐来检测5mC和5hmC。但这种测序方法仍有极大的限制，由于亚硫酸氢盐对DNA的降解率达99％，在处理有限的样本时（如血液中的cfDNA），亚硫酸氢盐测序将变得非常具有挑战性。此外，亚硫酸氢盐测序是间接检测5mC和5hmC。由于未修饰的胞嘧啶约占人类基因组总胞嘧啶的95％。将所有未修饰的胞嘧啶转换为尿嘧啶会严重降低序列复杂性，导至测序质量差，定位效率低，基因组覆盖不均匀和测序成本增加，这极大地限制了表观遗传的研究应用。

图1. 宋春啸（左）和Benjamin Schuster-Boeckler（右）。来源: LUDWIG CANCER RESEARCH

为准确检测DNA甲基化水平，最好的方法就是在不影响未修饰胞嘧啶和高分辨率的前提下，直接检测5mC和5hmC。2月25日，牛津大学路德维格癌症研究所宋春啸和Benjamin Schuster-Boeckler在Nature Biotechnology发表文章，报道了一种新的DNA甲基化测序方法：TET辅助吡啶硼烷测序（TET-assisted pyridine borane sequencing，TAPS）。与亚硫酸氢盐测序相比，TAPS无需亚硫酸氢盐，可对目标序列直接进行DNA甲基化测序，是一种破坏性更小、效率更高的单碱基分辨率DNA甲基化测序方法。

传统的DNA甲基化测序多是将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，新开发的TAPS“反其道而行之”，可在不影响未修饰胞嘧啶的前提下，实现5mC和5hmC的直接检测。TAPS方法包括两个步骤：首先利用TET酶将5mC和5hmC转化为第三种修饰，即5-羧基胞嘧啶（5caC）。然后，利用宋春啸教授实验室开发的一种新化学反应，将5caC转化为胸腺嘧啶，就可以通过普通测序仪直接测序。

研究数据显示，TAPS能够以高灵敏度和特异性检测DNA甲基化，保留DNA片段可超过10kb。同时，研究人员还基于TAPS开发了两种新方法：TAPS-β和CAPS，它们分别仅用于检测5mC或5hmC。

图2. Sanger测序结果显示，TAPS仅将5mC转换为T（左图）；通过HPLC-MS / MS定量dC和各种胞嘧啶衍生物的转化率（右图）。

图3. TAPS，TAPS-β和CAPS方法概述。

TAPS测序会产生一种新型数据，对此，研究人员针对性开发了数据分析所需的计算方法。与亚硫酸氢盐测序相比，TAPS数据的处理速度不仅快了2倍，而且还能保留样本更多的原始信息，使得在DNA甲基化检测中，基因突变检测和结构变异检测变得更加容易。

试验中，研究团队将TAPS应用于小鼠胚胎干细胞全基因组甲基化测序。结果表明，使用TAPS可检测E14基因组42,741,339个CpG位点中的88.3％，而WGBS仅为77.6％。TAPS的覆盖范围更均匀，定位效率更高，可以生成更精确的测序数据。此外，TAPS测序成本仅为WGBS的一半。这意味着，耗费同样多的钱，TAPS可以获得两倍多的有效数据，有助于进行更高质量、更全面的基因分析。

图4. 不同方法对E14基因进行至少三次读取的CpG位点覆盖情况，包括仅使用TAPS方法，TAPS和WGBS，仅使用WGBS方法。

在证明TAPS方法起作用后，该团队又花了一年时间来完善，使其反应效率从约70％提高到95％以上。目前，TAPS可与多种下游分析技术兼容，包括但不限于甲基化敏感性PCR、限制性酶切、质谱、全基因组测序等，还可与其他测序方法结合，进一步降低成本，提高分辨率。例如，TAPS可保留较长DNA序列，因此与长读长测序技术（如SMRT测序和纳米孔测序）结合或可用于研究某些此前难以研究的基因区域。此外，研究团队目前正在改进TAPS，利用其检测单细胞和血液中的ctDNA，以开发微创、无创的癌症诊断技术。

表观遗传修饰也被称为隐形标记，可控制基因表达及其在基因组中的分布。深入了解表观遗传信息有助于研究跟踪癌症的发生进展和抗药机制。TAPS方法的开发使表观基因组测序更加准确、经济，也有利于DNA甲基化测序能更广泛地应用于学术研究和临床。随着测序技术的不断发展，相信会有更多更好的甲基化测序技术出现，取代亚硫酸氢盐测序，成为表观基因组测序的新标准。

参考资料：

1.A new sequencing method to detect DNA modifications of relevance to cancer

2.Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution

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