如何做 Western blot？

乔帮主

如何做 Western blot？
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同花顺

谁家好人放假study啊-快速分析Western blot。

队长是我

一、技术概述

• Southern Blot（DNA印迹杂交）
  

定义：用于检测和分析DNA的技术。
应用：遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等。

2. Northern Blot（RNA印迹杂交）
定义：用于检测和分析RNA的技术。
应用：检测RNA的表达水平，进而了解基因表达情况。

3. Western Blot（蛋白质免疫印迹）
定义：利用抗体特异性识别并检测蛋白质的技术。
应用：蛋白质鉴定、表达量检测、蛋白质互作研究等。

二、技术原理

1.Southern Blot
原理：利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，随后将DNA转移至固相支持物（如尼龙膜），与标记的探针进行杂交，最后通过放射自显影或酶反应显色检测特定DNA序列。
2. Northern Blot
原理：将RNA从琼脂糖凝胶中转移至固相支持物，通过甲醛或乙二醛使RNA变性，并与标记的探针杂交，最后通过放射自显影或酶反应显色检测特定RNA序列。
3. Western Blot
原理：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离蛋白质，然后转移至固相支持物，利用特异性抗体与蛋白质结合，再通过标记的二抗显色，从而检测目标蛋白质，


三、操作流程

Southern blot

• DNA样品电泳：从组织或细胞中提取DNA，使用限制酶消化DNA以切割成不同大小的片段，然后在琼脂糖凝胶上进行电泳。
  
• DNA变性和转膜：将电泳凝胶进行脱嘌呤处理，移至碱性溶液中浸泡，使DNA变性并断裂形成单链DNA片段。随后用中性pH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。将凝胶上的DNA片段转移到硝酸纤维素膜、尼龙膜或其他固相载体上。
  
• DNA固定：利用紫外线或热交联法将DNA固定在膜表面，以防止DNA折叠或剪断。然后将膜浸泡在温的低盐缓冲液中进行封闭。
  
• DNA探针标记：对制作好的核酸探针进行标记，通常使用同位素或地高辛标记。
  
• 预杂交：将转印后的滤膜置于预杂交液中，以封闭膜上所有能与DNA结合的位点。
  
• 杂交：将标记好的探针与膜上的DNA进行杂交。
  
• 洗膜：在洗膜液中清洗杂交后的膜，以去除未结合的探针和其他杂质。
  
• 检测：使用放射自显影或酶反应显色等方法检测杂交信号。
  

Northern blot

• 样品准备：选择适合的样品，可以是植物、动物或微生物的总RNA提取物，或组织匀浆液等。将样品在沸水中加热变性，以解开RNA的二级结构，提高检测的灵敏度。
  
• 凝胶电泳：将变性后的RNA样品在琼脂糖凝胶上进行电泳，根据分子量大小将不同大小的RNA分开。电泳结束后，将凝胶放入甲醛溶液中固定，以保持RNA分子在凝胶中的位置。
  
• 转膜：将固定好的凝胶放入Northern Blot膜上，使凝胶中的RNA分子按照大小顺序被转移到膜上。
  
• 杂交：将膜在适量的预杂交液中杂交，以封闭膜上的非特异性位点。然后，将杂交液中的探针加入到膜中，使探针与目标RNA分子特异性结合。
  
• 洗膜：在洗膜液中清洗杂交后的膜，以去除未结合的探针和其他杂质。
  
• 检测：使用放射自显影或酶反应显色等方法检测杂交信号。
  

Western blot

• 样品制备：收集细胞或组织样本，通过裂解、离心等方式提取蛋白质。
  
• 电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，根据分子量大小将蛋白质分离。
  
• 转膜：将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。这可以通过电转印或湿转等方法实现。
  
• 封闭：将膜浸泡在封闭液中，以封闭膜上的非特异性结合位点。
  
• 抗体孵育：将特异性抗体与膜上的蛋白质进行孵育，使抗体与目标蛋白质结合。
  
• 二抗孵育：将带有标记的二抗与膜上的特异性抗体进行孵育，以放大信号。
  
• 洗膜：在洗膜液中清洗膜，以去除未结合的抗体和其他杂质。
  
• 检测：使用化学发光、荧光或显色等方法检测信号，从而确定目标蛋白质的存在和表达水平。
  

清风寡欲

Western Blot（蛋白质免疫印迹）是一种在生物学和医学研究中广泛使用的技术，它允许科学家们通过检测蛋白质在凝胶电泳和转移过程中的完整性，以及在膜上的定位，来研究蛋白质的表达和功能。这项技术不仅为研究蛋白质的结构和功能提供了重要的工具，而且对于理解细胞和生物体的生物学过程具有深远的影响。
蛋白质免疫印迹是一项强大的技术，其精细和复杂的过程使其在科研中发挥着不可或缺的作用。它要求对蛋白质表达、分离和检测的深入理解，以及对凝胶电泳、转膜、抗原免疫反应等过程的熟练掌握。这种技术不仅可以用于检测蛋白质的绝对表达量，还可以用于研究蛋白质的修饰（如磷酸化、糖基化等）以及蛋白质之间的相互作用。


在实践中，蛋白质免疫印迹提供了丰富的信息，可以帮助我们理解生物体的生理和病理过程。例如，通过分析特定蛋白质在疾病发生发展过程中的变化，我们可以更深入地理解疾病的发病机制，为疾病的预防、诊断和治疗提供新的思路。此外，蛋白质免疫印迹还可以用于研究药物的作用机制，为药物的开发和优化提供依据。
蛋白质免疫印迹结果的准确性和重复性是这项技术的重要指标，需要经过严格的质量控制和操作规范。此外，由于涉及到大量的实验操作和复杂的分析过程，蛋白质免疫印迹也需要研究人员具备较高的实验技能和经验。
作为一个对蛋白质免疫印迹有所了解的人，我可以告诉你这项技术对于研究蛋白质表达和相互作用非常重要。当我第一次接触到蛋白质免疫印迹的时候，我简直是又兴奋又困惑。想象一下，你辛辛苦苦做了一个实验，想要确定一个特定蛋白质在你的细胞样本中是否存在，但你不能直接看到蛋白质，这真的让人沮丧。然而，蛋白质免疫印迹技术的出现，彻底改变了这一切。
蛋白质免疫印迹不仅仅可以告诉我们一个蛋白质是否存在，还可以提供信息关于其大小和相对丰度。当我第一次在实验室中成功地得到免疫印迹结果时，我真的是激动不已。那种成就感和满足感是无法言喻的。


蛋白质免疫印迹技术是一项非常重要的工具，它在生物学研究中扮演着至关重要的角色。它让我们能够更深入地了解蛋白质的功能和相互作用，这对于推动科学的进步是至关重要的。这项技术让我们能够深入研究蛋白质的表达和功能，为理解生命活动的奥秘提供了新的视角。同时，它也为我们提供了新的可能性，即通过改变蛋白质的表达或功能来治疗疾病，甚至发现新的药物靶点。然而，蛋白质免疫印迹并非易事，需要我们投入大量的时间和精力去学习和掌握。但只要我们坚持不懈，就一定能够在这个过程中收获满满的成就感和对生命的更深层次的理解。
致谢：
感谢文彬兄为“蛋白质免疫印迹”题字。感谢铁子们在过去一年对“科研不好找”的关注。



文彬兄题字

大力水手

1、转膜不充分

(1)膜没有完全均匀湿透
使用100% methanol浸透膜。
(2)靶蛋白分子量小于10 000
选择小孔径的膜，缩短转移时间。
(3)靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液pH值
可尝试使用其他缓冲液如CAPS缓冲液（pH 10.5)或使用低pH值缓冲液如乙酸缓冲液。
(4)甲醇浓度过高
过高甲醇浓度会导致蛋白质与SDS分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替。
(5)转移时间不够
对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间。
2、背景高

(1)膜没有完全均匀湿透
使用100% methanol浸透膜。
(2)洗膜不充分
增加洗液体积和洗涤次数。
(3)阻断不充分
增加封闭液孵育时间，或者提高温度。选择合适的封闭试剂（脱脂奶粉，BSA，酪蛋白等）。
(3)二抗浓度过高
降低二抗浓度。
(4)检测过程中膜干燥
保证充分的反应液，避免出现干膜现象。
(5)曝光过度
缩短曝光时间。
(6)抗体与阻断蛋白有交叉反应
检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应。
3、没有阳性条带

（1）抗体染色不充分
增加抗体浓度，延长孵育时间。
（2）酶失活
直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。
（3）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低
设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因。
（4）试剂不匹配
一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性。
（5）一抗失效
选择在有效期内抗体；并选择现配现用的工作液。
（6）HRP抑制剂
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。
4、有阳性条带，但条带比较弱

（1）抗体染色不充分
增加抗体浓度，延长孵育时间。
（2）酶活性降低
直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。
（3）标本中靶蛋白含量太低
增加标本上样量。
（4）洗膜过度
缩短洗涤时间。
（5）HRP抑制剂
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。
（6）抗体活性降低
选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置。
（7）封闭过度
减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型。
（8）曝光时间过短
延长曝光时间。
（9）HRP抑制剂
所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。
5、条带位置（大小）不对；或有非特异性条带

（1）二抗的非特异性结合
增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）。
（2）一抗的特异性不够
使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性。
（3）蛋白降解
使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂。
（4）二聚体或多聚体存在
增加蛋白质变性过程及强度。
（5）抗体浓度过高
降低抗体（一抗、二抗）浓度，可以减少非特异性条带。
（6）蛋白上样量过大
降低上样量。
6、背景有斑点

（1）封闭剂中有聚集体
使用前过滤封闭试剂。
（2）HRP耦联二抗中有聚集体
过滤二抗试剂，去除聚集体。
7、膜上出现反像（暗背景上白色带）

（1）HRP含量过高
降低酶联二抗的浓度。
END

队长是我

MedChemExpress.cn

蛋白质印迹法 (免疫印迹试验) 即 Western Blot，其工作原理是经过 PAGE (根据分子大小) 分离的蛋白质样品，转移到固相载体 (例如硝酸纤维素薄膜) 上，然后将目的蛋白与特异性抗体进行孵化。
由于抗体只与目的蛋白结合，未结合的抗体被洗掉，只留下与目的蛋白结合的抗体。最后通过显影检测结合的抗体，条带灰度与蛋白量相对应，因此可以反映蛋白质的表达情况[1]。

WB 实验包括制样、电泳、转膜、孵育抗体和显影等多个步骤（如图 1），莫慌莫慌，小 M 带你来一一化解。




图 1. Western blot 的流程图[2]


1. 万丈高楼第一步：准备材料

要想实验节奏稳，准备工作那可要妥妥的——缓冲液配制。小 M 在此总结了 WB 实验中所涉及的各类缓冲液的配方，拿走拿走别客气～










表 1. Western blotting 各类缓冲液配方

默默问一句，看完这些配方，您倦了吗？疯狂计算，反复称量，您累了吗？小 M 且在这里为您献上 MCE 多种速溶颗粒产品 (可戳往期→让“速溶颗粒”解放你的双手)，不用犹豫，省时省力，您且受累收好呗！
2. 只要样品做得好，完美结果少不了

配好了溶液，就该轮到把样品的蛋白分离出来了！那么样品处理该注意什么呢？
低温操作！低温操作！低温操作！重要的事说三遍。为最大限度保证蛋白原有结构，所有涉及蛋白的操作都需在冰上进行！
2.1 细胞裂解液的制备

在冰上用预冷的 PBS 洗涤细胞。根据每 107 个细胞加 1 mL 裂解缓冲液的比例加入预冷的裂解缓冲液。细胞重悬液在 4 ℃ 下放置 5-10 分钟，期间剧烈震荡 3-4 次，每次 30 秒，实现充分裂解。放入离心机内，12,000 rpm 离心 13-15 分钟。将上清液转移到冰上预冷的离心管中，弃去沉淀。
如果是制备组织裂解液的话，解剖目标组织一定要迅速，建议多次离心去除杂质。
2.2 蛋白样本制备

取少量裂解液，通过 BCA 法进行蛋白浓度测定。取出 50 μg 蛋白对应的溶液至离心管中，加入 1×SDS 上样缓冲液调平体积。将样本缓冲液中的细胞裂解液在 100 ℃ 下煮沸 5-10 分钟。
3. 上样跑胶需选择合适凝胶

紧张又忙碌地制备完蛋白样品，然后就是上样和跑胶。(恰恰恰，跑个胶，先检查下作业呗！) 首先是根据蛋白大小选择合适的凝胶，参考下表 2。
然后将蛋白样品上样至 SDS-PAGE 凝胶孔中，记得在样品旁边的孔内点上 marker。细胞裂解液或组织匀浆的总蛋白上样量一般为 20-30 μg，电泳时长一般 1.5 小时，先用 80 V 跑 30分钟，使各样本处于同一水平，待 marker 开始分离后将电压调至 120 V 再跑 1小时。




表 2. 蛋白大小与推荐的凝胶百分比

4. 转膜不要丧气，成败在此一举

顺利到了转膜这一步，已经快完成实验啦~ 转膜分为湿转和半干转两种，转膜时间应根据蛋白大小进行相应调整。

湿转是指转印过程中凝胶和膜被浸入充满转印缓冲液的槽中，适用于大多数各种分子量的常规蛋白转印。
半干转是指凝胶和膜被夹在预先润湿缓冲液的滤纸之间，滤纸与平板电极直接接触。湿转使用更广泛，成本低；半干转相对来说更加节约时间，通常只需要 10 min 即可，具体时间视蛋白大小和仪器条件决定。
不论是半干转还是湿转，小 M 都有几个共通小 tips 要给你：

• 1 提前将 PVDF 膜浸入预冷的甲醇中 5s 来激活；
  
• 2 转膜时要注意赶走膜与胶之间的气泡；
  
• 3 转膜材料的放置顺序 (如图 2a)。
  

图 2. 转膜的物料顺序：阴极，海绵 (湿转需要)，滤纸，胶，PVDF 膜，滤纸，海绵 (湿转需要)，阳极[3]

5. 胜利的曙光：敷抗体显影

行百里者半于九十，大家在最后一步一定要坚持！通常，在孵育一抗前需要用封闭缓冲液在室温下封闭膜 1 小时，以使膜表面可有效地附着蛋白质或抗体，然后用 PBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟，接着将封闭后的膜与稀释后的一抗在 4 ℃ 下过夜孵育。
洗涤后使用稀释后的偶联二抗在封闭缓冲液中室温孵育 2 小时，用 PBST 洗涤后加入 ECL 显色液孵育 1-3 分钟，利用暗室显影技术采集化学发光图像。(注意注意：加入 ECL 显色液后应全程避光！否则前功尽弃)。
看到这里，相信大家对 western blot 的流程已经了然于心了吧，是不是迫不及待地想上手练习啦？
6. 一通操作猛如虎，一看结果想哭

WB 结果有问题怎么办？别怕！万能的小 M 仍有对策！详情可戳→我就不信这个邪！打破 Western Blot玄学操作。最后，贴心、暖心的小 M给大家奉上一系列相关产品，助大家一臂之力，快来看下吧
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