什么是基因编辑技术？

无锡耐思NEST

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]一、前言

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]每一个生命个体都是由无数精妙的生物分子共同组成的。而其中的DNA就像是生命的蓝图，DNA中的每一段特定序列，即我们所称的基因，各自承担着特定的生物学功能。它们共同调控着生物体的生长、发育、繁殖等一系列复杂的生命过程。然而，并非所有基因都是完美的，有时候，基因中的一点小小改变，就可能导至疾病的产生。但如果我们能够像编辑文字一样编辑这些基因，那我们就有可能修复这些错误，治疗疾病，甚至创造出新的生命形式。这个想法并非遥不可及。在21世纪的今天，一种名为"基因编辑"的技术正在逐渐实现这个梦想，它正在深刻地改变我们对生命的理解和认知。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]自1970年以来，基因工程已经成为一种在生物体中引入新遗传成分的主要手段。但这项技术有一个显著的缺点：DNA的插入是随机的，不能精确地将基因定位到生物基因组内的特定位点。这种随机性可能会损害或改变宿主基因组中的其他基因。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]为了解决这个问题，科学家们开始研发一系列的基因编辑技术。这些技术不仅能在基因组中插入新的基因，还能精确地将这些基因定位到特定的位置，避免对其他基因的无意干扰。基因编辑技术的出现，使得我们能够从"粗糙"的基因操作，转变为"精细"的基因操作。这一系列突破性的研究不仅提高了基因操作的准确性，也为我们解决遗传疾病和开发新的生物技术提供了更多可能性。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]二、基因编辑的原理

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]基因编辑的原理通常涉及到一种被称为"分子剪刀"（如CRISPR-Cas9，ZFNs或TALENs等）的工具，它可以在DNA链的特定位置将其切断。这个位置是由一段引导RNA（gRNA）确定的，它能够与目标DNA序列精确配对。一旦DNA被切断，细胞的自我修复机制就会启动，试图修复这个断裂。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]当DNA双链断裂（DSBs）发生时，细胞会启动一系列复杂的自我修复机制，试图修复这个断裂。这些机制包括同源重组修复（HR）、非同源末端连接（NHEJ）、选择性末端连接（a-EJ）和单链退火修复（SSA）。

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• 同源重组修复（HR）：同源重组修复（HR）是一种精确的DNA修复机制，但它需要一个同源的DNA模板来指导修复过程。同源模板通常来自于同源染色体或者姐妹染色单体。在基因编辑中，我们可以为人提供一个包含我们希望插入或替换的DNA序列的同源模板。通过精确控制模板的序列，我们就可以实现精确的基因编辑。但需要注意的是，HR机制主要发生在细胞的S期和G2期，因为这两个阶段细胞具有可供参考的姐妹染色单体。因此，在使用HR机制进行基因编辑时，我们通常需要考虑到细胞周期的影响。
  
  

• 非同源末端连接（NHEJ）：非同源末端连接（NHEJ）可以将断裂的两个DNA末端直接连接起来，而不需要同源性模板。这种机制的优点是可以在任何阶段的细胞周期中进行，而不受细胞分裂阶段的限制。NHEJ的缺点是它不是一个精确的修复机制。在末端连接的过程中，可能会丢失或插入一些核苷酸，导至基因序列的改变。这种改变可能会导至基因的功能丧失或改变，所以NHEJ常常在无法提供同源模板的情况下被用于实现基因的突变和敲除。
  
  

• 选择性末端连接（a-EJ）和单链退火修复（SSA）：这是两种辅助性的DNA修复机制，它们在特定的条件下被激活。a-EJ是一种不依赖于DNA-PKcs的末端连接机制，通常在非同源末端连接（NHEJ）不能正常工作时被激活。单链退火修复（SSA）则是一种依赖于大量的末端单链切除的修复机制。在SSA过程中，两个断裂的DNA末端会被切除成单链，然后这两个单链会寻找并退火到相同的序列，最后通过切除和连接的方式修复断裂。这两种修复机制都需要对断裂的DNA末端进行大量的切除，以形成单链DNA，这可能会导至一些遗传信息的丢失。因此，它们都不是精确的修复机制。但在基因编辑中，我们可以巧妙地利用这些机制来实现特定基因的突变和敲除。
  
  

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]而在DNA的自我修复过程中，科学家可以利用一种被称为"修复模板"的DNA片段来引导修复过程。这个修复模板包含了科学家想要插入、删除或更改的DNA序列。当细胞的修复机制被激活时，它就会使用这个修复模板来修复DNA断裂。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]三、锌指核酸酶技术（ZFN）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]锌指核酸酶（ZFN）技术的发展始于20世纪80年代。当时的科学家在非洲爪蟾的调节因子中发现了锌指蛋白（zinc finger protein，ZFP）。这种蛋白能够识别并结合到特定的DNA序列。后来，科学家发现通过改造这些蛋白可以将其与FokI酶结合，产生成为一个能够在特定DNA序列处切割DNA的工具，前者负责识别，后者负责切割DNA。这就是锌指核酸酶。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]1、ZFN技术的原理

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]ZFN由两部分组成：锌指蛋白（ZFP）和FokI内切酶。ZFP是一种DNA结合蛋白，它可以识别并结合到特定的DNA序列。FokI内切酶是一种核酸酶，它可以切割DNA。这两部分结合在一起，形成了一种可以在特定位置切割DNA的工具。

• 锌指蛋白（ZFP）：锌指蛋白由一个或多个锌指模块组成，每个模块可以识别并结合到DNA序列上的3个碱基。通过改变锌指模块的数量和类型，可以改变ZFN的识别特异性。例如，如果一个ZFN包含6个锌指模块，那么它可以识别18个碱基的DNA序列。这就使得ZFN能够非常精确地定位到基因组中的特定位置。
• FokI内切酶：FokI内切酶是ZFN的切割部分。它是一种核酸酶，可以在DNA双链上产生切口。然而，FokI内切酶只有在形成二聚体的情况下才能工作。这也就意味着需要两个ZFN分子在相邻的DNA序列上结合，才能形成一个有效的FokI内切酶二聚体，从而切割DNA。
• DNA切割和修复：当ZFN在特定的DNA序列上产生切口后，细胞的DNA修复机制就会启动。这通常会通过两种途径进行：非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）。NHEJ是一种错误修复机制，它会在DNA切口处随机添加或删除碱基，从而导至基因突变。HR则是一种精确的修复机制，它需要一个与切口处的DNA序列相匹配的模板，接着按照这个模板精确地修复切口。通过提供一个含有所需变更的DNA模板，科学家们就可以利用HR机制来进行精确的基因编辑。
  
  

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锌指核酸酶图（图片来源：Stewart, CN 和 Burris, J. Jr.）

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]2、ZFN技术的应用

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]自2001年以来，ZFN已经被广泛应用于各种生物物种的基因编辑。这包括细菌、酵母、植物、昆虫、哺乳动物，甚至包括人类细胞。ZFN技术的一个主要应用是基因敲除，这是通过切割目标基因的DNA序列，然后让细胞的DNA修复机制产生错误，从而使基因失去功能。ZFN也可以用于基因插入，这是通过在目标DNA序列上创建一个切口，然后插入一个新的DNA片段。此外，ZFN还可以用于基因修复，这是通过切割错误的基因序列，然后引导细胞的DNA修复机制使用一个正确的模板来修复错误。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]3、ZFN技术的优点和挑战

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]ZFN的主要优点是其高度的特异性和灵活性。它可以设计成识别并切割几乎任何DNA序列。然而，设计和构建ZFN是一个复杂的过程，需要大量的时间和资源。ZFN也有可能在非目标位置切割DNA，这可能导至不期望的突变。尽管有这些挑战，ZFN仍然是一种强大的基因编辑工具，已经在许多研究和临床试验中显示出巨大的潜力。

四、转录激活样效应因子核酸酶技术（TALEN）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]转录激活样效应（Transcription Activator-Like Effector, TALE）核酸酶（Nucleases, TALENs）是一种基因编辑工具，其工作原理与锌指核酸酶（ZFNs）类似，但是它们使用不同的DNA结合蛋白。TALEN是一种人工制造的蛋白质，由两部分组成：一个DNA结合域（TALE）和一个FokI核酸酶。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]1、TALE DNA结合域

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]TALE蛋白是由植物病原体Xanthomonas细菌产生的，它们可以识别并结合到植物基因中的特定序列，进而改变植物的基因表达。TALE蛋白的DNA结合域由多个重复的氨基酸序列组成，每个重复序列由34（或35）个氨基酸组成，可以识别并结合一个DNA碱基。这种结构使得TALE蛋白可以高度特异地识别并结合到特定的DNA序列。TALE基序串联成决定靶向性的DNA识别模块通过与FokⅠ结构域连接，就形成了TALEN结构。

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2、TALEN技术的优点和挑战

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]TALENs的DNA识别模块由一系列的转录激活样效应物（TALE）基序组成，每个基序可以识别并结合一个DNA碱基。这种一对一的识别模式使得TALENs能够非常精确地定位到基因组中的特定位置。此外，TALENs使用的FokI核酸酶与ZFNs中的相同，这也保证了TALENs有与ZFNs相当的切割效率。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]当然，TALENs也存在一些局限性。首先，由于TALENs的尺寸要大于ZFNs，因此它们在某些应用中可能会受到限制，例如，较大的尺寸可能会影响到TALENs在细胞中的传递效率。其次，TALENs的DNA识别模块包含大量的重复序列，这可能会增加在大肠杆菌中组装TALENs编码基因的难度。然而，这些问题可以通过各种策略来解决，例如使用特殊的组装方法或改进的传递系统。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]五、成簇规律间隔短回文重复序列-相关核酸酶技术（CRISPR-Cas）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]CRISPR-Cas（成簇规律间隔短回文重复序列-相关核酸酶）系统是一种在细菌和古菌中发现的自然免疫机制，用于防御病毒和外源质粒。目前这个系统已经被广泛应用于基因编辑。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]CRISPR-Cas系统主要由两个组成部分构成：CRISPR序列和Cas蛋白。

• CRISPR序列：CRISPR是一段DNA序列，由短的重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）组成。重复序列高度保守，而间隔序列则来源于过去入侵的病毒或质粒，因此是特异的。
• Cas蛋白：Cas蛋白是一种核酸酶，能够切割DNA或RNA。Cas蛋白的种类很多，其中最著名的是Cas9蛋白，被广泛用于基因编辑。
  
  

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]CRISPR-Cas系统的工作过程可以分为三个阶段：

• 适应阶段：当病毒或质粒入侵时，细菌或古菌会从入侵者的基因中切割出一段DNA，然后插入到自己的CRISPR序列中，形成新的间隔序列。
• 表达阶段：当同样的病毒或质粒再次入侵时，细菌或古菌会将CRISPR序列转录成RNA（称为crRNA）。这些crRNA含有来自间隔序列的部分，因此可以识别入侵者的基因序列。
• 干扰阶段：crRNA会引导Cas蛋白找到并切割入侵者的基因，从而防止入侵者的复制。
  
  

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]CRISPR-Cas系统的原理：

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]在CRISPR-Cas9系统中，科学家们通常将crRNA和另一种名为tracrRNA的RNA被设计成一个单一的导向RNA（sgRNA）。sgRNA可以引导Cas9蛋白精确地切割目标基因。

• 设计sgRNA：首先，需要设计一个sgRNA，它的目标序列与你想要编辑的基因序列相配对。sgRNA通常由一个20个核苷酸的目标序列和一个与Cas蛋白结合的骨架序列组成。
• sgRNA和Cas蛋白的结合：然后，sgRNA会结合到Cas蛋白上，形成一个sgRNA-Cas复合体。在这个复合体中，sgRNA负责识别目标DNA，Cas蛋白负责切割DNA。
• DNA识别和切割：sgRNA-Cas复合体会在细胞中寻找与sgRNA目标序列配对的DNA序列。一旦找到，Cas蛋白就会在这个地方切割DNA，产生一个双链断裂。
• DNA修复：细胞会启动自身的DNA修复机制来修复这个双链断裂。如果在双链断裂发生的地方提供一个含有所需突变的同源模板，那么在修复过程中就会将这个突变插入到基因中，从而实现精确的基因编辑。
  
  
  

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]CRISPR-Cas系统的优点是它的操作简单，特异性高，可以在任何生物体内实现精确的基因编辑。然而，它也有一些缺点，比如可能产生非特异性切割，或者在修复过程中产生意外的突变。

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[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]​小结

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]基因编辑技术已经在生物科学研究和应用中起到了革命性的作用。从早期的锌指核酸酶（ZFN）和转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）技术，到现在广泛应用的CRISPR-Cas系统，基因编辑技术的发展不仅提高了我们对生命过程的理解，也为治疗遗传疾病、改良农作物和开发新的生物技术提供了强大的工具。虽然这些技术都有各自的优点和挑战，但是它们的出现无疑已经极大地推动了生物科学的进步。相信在未来，随着基因编辑技术的进一步发展和优化，我们期待能够看到更多的基因编辑应用，从而更好地服务于人类社会。#基因编辑#