蛋白质翻译后修饰SUMO化是什么意思？

无锡耐思NEST

SUMO化修饰（SUMOylation）是一种蛋白质的翻译后修饰，也是一种类泛素化修饰。它涉及小泛素样修饰物(SUMO)与底物上赖氨酸残基的共价连接。在哺乳动物中，已经鉴定出三种主要的SUMO亚型，包括SUMO1、SUMO2和SUMO3。与泛素化相似，SUMO化由一系列酶催化，包括E1 SUMO活化酶(SAE1/SAE2)、单个E2偶联酶(UBC9)和有限的E3 SUMO连接酶。SUMO化修饰介导靶分子定位与功能调节。目前，SUMO化修饰在细胞生物学中的作用非常广泛，也是当前研究的热点之一。SUMO化和去SUMO化的失衡与多种疾病的发生和发展有关，包括癌症、神经退行性疾病、心脏病以及先天免疫性疾病。接下来一起来看篇文献：

研究背景：

SUMOylation调节了大量的生物过程，其抑制剂目前正在临床试验中作为抗癌药物进行研究。因此，确定具有位点特异性SUMOylation的新靶点并确定其生物学功能不仅将为SUMOylation信号传导提供新的机制见解，还将为开发新的癌症治疗策略开辟道路。MORC家族CW型锌指2 (MORC2)是一种新发现的染色质重塑酶，在DNA损伤反应(DDR)中起着新兴的作用，但其调控机制尚不清楚。

主要方法：

采用体内和体外SUMO化法测定MORC2的SUMO化水平。SUMO相关酶的过表达和敲低检测其对MORC2 SUMO化的影响。通过体外和体内功能试验，探讨动态MORC2 SUMO化对乳腺癌细胞对化疗药物敏感性的影响。使用免疫沉淀、GST下拉、MNase和染色质分离分析来探索潜在的机制。

主要结果：

MORC2由SUMO1和SUMO2/3修改

为了确定MORC2是否被SUMOylation修饰，作者将Flag-MORC2瞬时转染到HEK293T细胞中，并在变性条件下使用抗Flag珠进行SUMOylation实验。用抗SUMO1或抗SUMO2/3抗体进行免疫印迹分析显示，SUMO1和SUMO2/3与MORC2偶联。此外，在MCF-7、T47D和HEK293T细胞中检测到SUMO1和SUMO2/3与内源性MORC2的结合。用SUMOylation抑制剂ML-792孵化会导至HEK293T细胞中异位表达的Flag-MORC2和MCF-7和T47D细胞中内源性MORC2的SUMOylation以剂量依赖性的方式降低。免疫荧光染色显示，内源性SUMO1和SUMO2/3在HEK293T细胞中与外源性Flag-MORC2共定位，在MCF-7和T47D细胞中与内源性MORC2共定位。这些结果表明，在哺乳动物细胞中，所有三种SUMO亚型都与MORC2共价结合。

由于UBC9是SUMOylation所必需的唯一E2偶联酶，作者接下来通过免疫沉淀实验研究了MORC2是否与UBC9相互作用。当HA-UBC9和Flag-MORC2在HEK293T细胞中共表达时，Flag-MORC2被HA-UBC9免疫沉淀。在HEK293T细胞中检测到MORC2和UBC9在内源性蛋白水平上的相互作用。在HA-UBC9存在的情况下，所有三种SUMO亚型(GFP标记的SUMO1、SUMO2和SUMO3)都与MORC2结合。HA-UBC9的异位表达增强，而通过CRISPR/Cas9技术敲除内源性UBC9降低了MCF-7细胞中内源性MORC2的SUMOylation。总之，这些结果表明MORC2是一种SUMO化的蛋白。

赖氨酸767 (K767)是MORC2中主要的SUMOylation位点

为了确定MORC2潜在的SUMOylation位点，作者使用GPS (group-based prediction system)-SUMO和JASSA (Joint Analyzer of SUMOylation site and SIMs)程序来预测MORC2的SUMOylation位点。将MORC2中潜在的SUMOylation位点缩小到赖氨酸767 (K767)和K827。为了验证MORC2是否在这两个位点被SUMO化，作者分别将K767和K827突变为不可SUMO化的残基精氨酸(R)，然后将野生型(WT)、K767R或K827R突变体Flag-MORC2与GFP-SUMO1、GFP-SUMO2或GFP-SUMO3瞬时转染到HEK293T细胞中。用所示抗体进行的SUMOylation分析显示，与WT对应的突变体相比，在表达K767R的细胞中，SUMO1和SUMO2/3的修饰减少，而K827R的突变体MORC2则没有减少。此外，与WT MORC2相比，内源性SUMO1和SUMO2/3与K767R突变体Flag-MORC2的结合减少。这些结果表明K767是MORC2的主要SUMO位点。

在MORC2的N端有一个功能性的SIM是其有效的SUMOylation所必需的

SIM是一些SUMO底物高效SUMO化所需的。使用GPS-SUMO和JASSA程序分析MORC2蛋白序列，发现MORC2中存在两个假定的SIMs，分别位于144-148和413-417残基中，称为SIM1和SIM2。为了评估这两个SIMs在MORC2 SUMOylation中的功能重要性，作者分别用丙氨酸取代疏水残基(这里称为SIM1mut和SIM2mut)来突变两个SIM序列。SUMOylation实验显示，Flag-MORC2 SIM1mut，而非SIM2mut，降低了MORC2 SUMOylation 。

蛋白质相互作用数据库BioGRID分析发现两个假定的SUMO E3连接酶，TRIM28和chromobox 4 (CBX4)。虽然在HEK293T细胞中Flag-MORC2与内源性CBX4相关，但Flag-CBX4的异位表达并未显著影响Flag-MORC2的SUMOylation，表明CBX4不是MORC2 SUMOylation的SUMO E3连接酶。

接下来，作者研究了TRIM28是否诱导MORC2 SUMO化。IP和免疫印迹实验显示，在HEK293T细胞中，Flag-MORC2与HA-TRIM28共免疫沉淀。免疫荧光染色显示MCF-7细胞的细胞核中也可见Flag-MORC2和HA-TRIM28的共定位。此外，在MCF-7细胞中检测到内源性MORC2和内源性TRIM28之间的关联。

为了绘制MORC2与TRIM28相互作用所需的结构域，作者在HEK293T细胞中生成了三个MORC2缺失和截断结构，并进行了co-IP测定。MORC2的N端包含保守的ATP酶结构域是其与TRIM28相互作用所必需的。同样，在其N端缺失1-420残基的MORC2无法与TRIM28结合。这些结果表明，MORC2的N端ATPase结构域对其与TRIM28的相互作用至关重要。

为了确定MORC2 SUMOylation是否需要TRIM28，作者异位表达HA-TRIM28并检测MORC2 SUMOylation水平。异位TRIM28显著增强了WT的SUMO化，但对K767R突变体MORC2没有作用。此外，过表达TRIM28对MORC2蛋白水平没有显著影响。此外，只有过表达WT TRIM28，而不是其催化失活性的C651A突变体，才能有效地增强MORC2的SUMOylation 。相反，两个独立shRNAs敲低TRIM28，可显著降低HEK293T细胞中异位表达的Flag-MORC2的SUMOylation和MCF-7细胞中内源性MORC2的SUMOylation。这些结果表明TRIM28是MORC2 SUMOylation所需的SUMO E3连接酶。

SENP1是一种MORC2去SUMO化酶

由于MORC2被所有三种SUMO亚型修饰，作者接下来研究了SENP1-3在MORC2去SUMO化中的潜在作用。为此，将Flag-MORC2、HA-UBC9和GFP-SUMO转染到HEK293T细胞中。结果显示，与SENP1和SENP2共转染后，MORC2的SUMOylation被减弱，而SENP3没有减弱。免疫荧光染色显示，HA-SENP1在细胞核中与Flag-MORC2共定位，而HA-SENP2和HA-SENP3则没有共定位。

为了确定SENP1是否介导MORC2去SUMO化，作者检测了SENP1和MORC2之间的相互作用。IP分析表明，SENP1与MORC2相互作用。在MCF-7细胞中观察到SENP1和MORC2在内源性蛋白水平上的相互作用。此外，SENP1过表达显著降低HEK293T细胞中异位表达的MORC2和MCF-7细胞中内源性MORC2的SUMOylation。WT SENP1的异位表达，而不是其催化无活性的C603S突变体，有效地消除了MORC2的SUMOylation。同样，SENP1的缺失在HEK293T和MCF-7细胞中显著诱导MORC2 SUMOylation。

DNA损伤后，MORC2的SUMOylation降低

由于SUMOylation与DNA损伤应答（DDR）有关，作者接下来测量了DNA损伤剂是否影响MORC2的SUMOylation。用ADR（阿霉素）处理HEK293T细胞2小时后，MORC2 SUMOylation以剂量依赖性的方式降低。

在HEK293T细胞恢复后，ADR引起的MORC2 SUMOylation的快速丧失得以恢复。这些结果表明，MORC2 SUMOylation对DNA损伤的反应是高度动态的。为了研究MORC2 SUMOylation在DNA损伤下动态变化的潜在机制，作者测试了ADR是否会影响MORC2与TRIM28或SENP1的相互作用。用ADR处理2小时后，TRIM28或SENP1的蛋白水平没有明显改变，但MORC2与TRIM28的相互作用明显降低，而SENP1没有。有趣的是，在恢复指定时间后，MORC2和TRIM28之间受损的相互作用得以恢复，同时MORC2与SENP1的关联略有下降。TRIM28的敲低显著损害了ADR处理后MORC2 SUMOylation的恢复。这些数据表明，精确调控的MORC2 SUMOylation主要依赖于TRIM28对DNA损伤的反应。

先前的研究表明，MORC2在DNA损伤时发挥ATP酶依赖的染色质重塑活性。接下来，作者确定了DDR早期MORC2 deSUMOylation是否与其染色质重塑活性有关。用ADR处理表达WT MORC2的细胞增强了染色质对MNase的可及性。此外，这种效应在表达SUMOylation缺陷的MORC2 (K767R或SIM1mut)的细胞中增强。作者应用染色质分离测定来鉴定染色质的不同性质。抗核酸酶染色质组分富集了组蛋白3赖氨酸9三甲基化(H3K9me3)，这是异染色质形成的标志，表明高度浓缩的染色质核小体。ADR处理将富含H3K9me3的核小体从C5部分转移到对核酸酶更敏感的C4部分。这一发现证实了人们普遍持有的观点，即受损的染色质相对更容易接近。然后作者测试了MORC2 SUMOylation是否参与了这一过程。在不良反应治疗后，WT MORC2的表达降低了C5部分中富含H3K9me3的核小体染色质。此外，SUMOylation缺陷的MORC2突变体增强了这种效应。因此，基因毒性损伤后，依赖MORC2染色质重塑活性的染色质可及性的增加通过deSUMOylation得到增强，从而进一步促进DNA修复。

DNA损伤后，MORC2的SUMOylation降低

由于SUMOylation与DNA损伤应答（DDR）有关，作者接下来测量了DNA损伤剂是否影响MORC2的SUMOylation。用ADR（阿霉素）处理HEK293T细胞2小时后，MORC2 SUMOylation以剂量依赖性的方式降低。

在HEK293T细胞恢复后，ADR引起的MORC2 SUMOylation的快速丧失得以恢复。这些结果表明，MORC2 SUMOylation对DNA损伤的反应是高度动态的。为了研究MORC2 SUMOylation在DNA损伤下动态变化的潜在机制，作者测试了ADR是否会影响MORC2与TRIM28或SENP1的相互作用。用ADR处理2小时后，TRIM28或SENP1的蛋白水平没有明显改变，但MORC2与TRIM28的相互作用明显降低，而SENP1没有。有趣的是，在恢复指定时间后，MORC2和TRIM28之间受损的相互作用得以恢复，同时MORC2与SENP1的关联略有下降。TRIM28的敲低显著损害了ADR处理后MORC2 SUMOylation的恢复。这些数据表明，精确调控的MORC2 SUMOylation主要依赖于TRIM28对DNA损伤的反应。

先前的研究表明，MORC2在DNA损伤时发挥ATP酶依赖的染色质重塑活性。接下来，作者确定了DDR早期MORC2 deSUMOylation是否与其染色质重塑活性有关。用ADR处理表达WT MORC2的细胞增强了染色质对MNase的可及性。此外，这种效应在表达SUMOylation缺陷的MORC2 (K767R或SIM1mut)的细胞中增强。作者应用染色质分离测定来鉴定染色质的不同性质。抗核酸酶染色质组分富集了组蛋白3赖氨酸9三甲基化(H3K9me3)，这是异染色质形成的标志，表明高度浓缩的染色质核小体。ADR处理将富含H3K9me3的核小体从C5部分转移到对核酸酶更敏感的C4部分。这一发现证实了人们普遍持有的观点，即受损的染色质相对更容易接近。然后作者测试了MORC2 SUMOylation是否参与了这一过程。在不良反应治疗后，WT MORC2的表达降低了C5部分中富含H3K9me3的核小体染色质。此外，SUMOylation缺陷的MORC2突变体增强了这种效应。因此，基因毒性损伤后，依赖MORC2染色质重塑活性的染色质可及性的增加通过deSUMOylation得到增强，从而进一步促进DNA修复。

MORC2 SUMOylation是细胞在DNA损伤剂作用下存活所必需的

接下来，作者研究了SUMOylation是否介导MORC2在DNA修复过程中的生物学功能，从而影响基因毒性应激下的细胞存活。为了消除内源性MORC2的潜在影响，作者敲除MCF-7和T47D细胞中的内源性MORC2，然后通过慢病毒感染重组WT、SUMOylation-缺陷突变体K767R和SIM1mut MORC2。细胞用DNA损伤剂ADR处理30min后恢复24h，免疫荧光染色检测Ser139上磷酸化组蛋白H2AX (γH2AX)的水平。DNA损伤后γH2AX的长期存在表明DNA修复缺陷。在恢复24小时后，表达K767R和SIM1mut突变体MORC2的细胞比表达WT MORC2的细胞有更高水平的γH2AX灶，这表明SUMOylation缺陷突变体导至清除DNA病变的效率低下。菌落形成实验显示，WT MORC2降低了细胞对ADR和另一种DNA损伤剂MMS的敏感性，而K767R或SIM1mut突变体则没有。CCK-8试验表明，MORC2的SUMOylation对细胞对ADR的敏感性也有类似的影响。这些数据表明，在基因毒性应激反应中，MORC2 SUMOylation是细胞存活所必需的。

为了验证MORC2 SUMOylation是否在乳腺癌细胞对ADR的耐药性中起重要作用，作者用人LM2-4175细胞建立了异种移植肿瘤模型。将MORC2缺失的LM2-4175细胞与稳定重组的WT或K767R MORC2皮下注射到裸鼠。小鼠腹腔注射3mg/kg ADR，监测异种移植物肿瘤生长情况。如图7G-H所示，ADR处理后，表达K767R突变MORC2的肿瘤比表达WT MORC2的肿瘤体积更小、重量更轻，说明MORC2 K767R突变细胞对ADR更敏感。

综上所述，本文的研究结果表明，在K767位点，MORC2受到SUMO1和SUMO2/3的修饰，该事件受到SUMO E3连接酶TRIM28和SENP1的精确调控。此外，动态调节的SUMOylated MORC2对于DNA损伤的染色质重塑和DNA修复至关重要，并驱动乳腺癌的化疗耐药。因此，使用SUMO抑制剂干扰MORC2的SUMO化是逆转MORC2驱动的化学耐药的潜在策略。