干货分享 | 知其然知其所以然，WB、IP、IHC、IF、ChIP、FC六种抗体的区别

与光同辉

你是不是有同样的疑问？


查询抗体的时候，发现在抗体应用栏中，有的抗体适用于WB、IP、IHC、IF、F、CHIP，而有的抗体适用于WB、IHC、IF、F，不适用于IP和CHIP。那WB、 IP、 IF、IHC、F到底代表什么，这些抗体为什么不能通用？



生物医学领域的研究离不开抗体，WB（western blot，蛋白质印迹），IP(immunoprecipitation，免疫沉淀)，IHC(immunohistochemical，免疫组化)，IF(immunofluorescence 免疫荧光)，ChIP(Chromatin immunoprecipitation，染色质免疫沉淀)，F(flowcytometry，FC，流式细胞术) 都需要用到抗体，那么这几种实验方法中的抗体有什么区别呢？
WB，IP，IHC，IF，ChIP，FC抗体的区别


WB：蛋白质印迹是生命科学实验中一项常见的分子生物学实验技术，原理为利用电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，接着将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法，通过分析条带大小和显色信号获得目标蛋白质在所分析的细胞或组织样本表达情况的信息。由于蛋白质进行电泳前进行加热变性，破坏了保持蛋白质二级和三级结构的氢键，并使蛋白质线性化，需使用识别线性抗原表位的抗体。因此WB抗体一般采用人工合成多肽作为抗原制备的抗体。



IF/IHC：免疫组化是利用标记抗体经抗原抗体特异性免疫反应和化学/荧光呈色反应，对组织或细胞内的抗原进行研究的技术。免疫组化检测需要进行固定，固定可防止细胞脱落，并尽量让细胞的形态结构维持和天然状态下一致，确保组织细胞抗原特异性的稳定。但化学物质的固定使蛋白质变性凝固，与天然状态下的蛋白质结构有一定的区别，但是又不同于WB中加热变性变成线性的结构。



免疫组化抗体识别的是未经加热变性处理的抗原表位，有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和变性后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，加热变性会消失。因此在做IF/IHC实验中，最合适的抗体可以是用重组蛋白作为抗原制备的抗体，也可以是人工合成多肽作为抗原制备的抗体。如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB，而如果抗体识别的是构象表位，则只能用于免疫组化。



IP/CHIP：免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原抗体特异性反应纯化富集样品中目的蛋白的一种方法。通常使目标蛋白同对应抗体-protein A/G形成免疫复合物沉淀而得以收集。根据不同种类的检测目标，可以将IP技术分为：CHIP、RIP、Co-lP。IP富集蛋白，检测与其结合的DNA的方法即为ChIP；检测与其结合的RNA的方法即为RIP；检测与其结合的蛋白的方法即为Co-IP。



免疫沉淀是用抗体去识别天然状态下的蛋白质，因此IP的抗体最好使用天然蛋白作为抗原制备的抗体，也可以用重组蛋白作为抗原制备的抗体。最好不要用人工合成多肽作为抗原制备的抗体，因为这种抗体识别的位点可能包裹在蛋白内部而无法识别。CHIP和IP没有太大的区别，唯一的问题在于，如果抗体识别的抗原表位和该蛋白质与DNA结合的部位一致，则会导至CHIP实验的失败。



FC：流式细胞是以免疫荧光技术为基础而发展起来的一种专门的细胞分析技术，主要用于细胞分析和分选。流式细胞中分为两种，一种是活细胞的流式，这种流式最好采用天然蛋白作为抗原制备的抗体或者用重组蛋白作为抗原制备的抗体，另外一种是经过固定之后的流式，和IF/IHC 所用抗体一致。

在流式细胞中，分为直接标记和间接标记，间接标记不如直接标记真实准确。因此选择流式抗体要采用带有荧光标记的一抗；如果研究的蛋白没有直接标记的一抗，那么就采用间接标记抗体，需同时使用可识别靶标抗原一抗和偶联荧光染色的二抗。

注意


WB，IF，IHC和ELISA抗体稀释浓度关系

一般而言，抗体研发出来之后都要经过WB，IP，IF，IHC实验。当发现浓度不够做IF，IHC时候，国外的抗体一般标注未检测，国内的抗体一般是不写。

通常WB/FC抗体稀释浓度为1:1000，IP/IF/IHC为1:100，而如果可以做ELISA则可以稀释1:10000。如果一个抗体用来做ELISA的，那么言外之意就是该抗体效价不高。但不是说ELISA的抗体不能用于做WB，抗体说明书提示做ELISA稀释比例为1:10000，那么你可以试试1:1000做WB。



为什么会出现种种情况？

WB是将抗原通过SDS-PAGE电泳分离纯化，再通过电转到膜上；IHC是将组织固定在石蜡切片中；ELISA是将抗体特异性吸附固定在孔板中，再捕获样本中的抗原。其中ELISA有相对较大的抗原抗体结合表面积，增加抗原抗体的结合量，所以抗体稀释浓度比例最大是ELISA（1:10000），其次是WB/FCM（1:1000），最后是IP/IF/IHC（1:100）。



在实际使用中，由于每个实验室的样本来源、诱导方法、实验方案不同，对抗体要求也可能不同，因此最佳抗体浓度有时和推荐浓度不同。如果是首次使用的抗体，建议在这个比例上下设置几个梯度先用阳性对照实验一下，确定适用您实验条件的抗体浓度。举几个例子，小分子的免疫原性比较低，需要较高的抗体浓度；IP实验对抗体浓度要求也较高；经过偶联标记物处理，可能造成抗体亲和力降低，从而需要更高的抗体浓度。