干货分享 | 手把手教你做“蛋白纯化”

与光同辉

蛋白纯化是指通过基因工程技术将编码蛋白的核酸序列导入到宿主细胞，使其大量表达，再使用适当的纯化方法将其在体外纯化出来，从而获得高纯度、活性和产量的蛋白质。蛋白质表达系统可以分为原核表达系统和真核表达系统两大类。

下面介绍在原核系统中诱导表达蛋白质并使用亲和层析的方法体外纯化蛋白的原理和方法。

原理


1、乳糖操纵子的负调控：在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态，此时，I序列表达Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录启动。当有乳糖存在时，乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为异乳糖，异乳糖结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导至阻遏蛋白与O序列解离，从而启动转录。



  异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用与异乳糖相同，是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。
2、宿主菌株的选择：



（1）BL21是最常用于原核表达的菌株之一，主要适用于非毒性蛋白的表达，具有大肠杆菌聚合酶，故可适用于tac或trc等使用大肠杆菌RNA聚合酶的原核系统的表达（如：pGEX，pMAL质粒）。



（2）BL21(DE3)在BL21菌株的染色体上整合了λ噬菌体DE3区的T7噬菌体RNA聚合酶基因，可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的表达。



3、蛋白质的纯化方法：



（1）凝胶过滤层析：根据分子大小从混合物中分离蛋白质，不同蛋白的形状及分子大小存在差异，在混合物通过含有填充颗粒的凝胶过滤层析柱时，由于各种蛋白的分子大小不同，扩散进入特定大小孔径颗粒内的能力也各异，大的蛋白分子会被先洗脱出来，分子越小越晚洗脱。



（2）离子交换层析：依据蛋白表面所带电荷量不同进行蛋白分离纯化，蛋白表面通常会均匀带有一定的电荷，在一定条件下可以与阳/阴离子交换柱结合。在改变pH或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时，结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同物质的电荷不同，与离子交换柱的结合能力也不同，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同。



（3）疏水作用层析：利用蛋白质的疏水性，蛋白经变性处理或处于高盐环境下疏水残基会暴露于蛋白表面，不同蛋白疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱不同，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水用作由弱至强的组分分离。



（4）亲和层析：把待纯化的某一蛋白质（或在蛋白质上加上标签）的特异配体通过适当的化学方法共价连接到载体分子上，当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时，待纯化的蛋白质与配体特异性结合，而其他蛋白质则不被结合，通过洗涤除去，被特异结合的蛋白质可以用含游离的相应配体溶液洗脱下来。
His标签纯化：组氨酸标记（His-tag）是最常用的标签之一，在蛋白质的氨基端或羧基端加上6~10 个组氨酸，在一般条件或变性条件（如8M 尿素）下借助它能与Ni2+螯合柱紧紧结合的能力，再用咪唑洗脱（竞争性地与珠孔内的镍离子介质结合），使得目的蛋白被纯化出来。

器材


实验试剂：



IPTG；LB培养基；



Lysis buffer：20mM Tris (7.9)、500mM NaCl、10mM Imidazole；

Wash buffer：20mM Tris (7.9)、500mM NaCl、20mM Imidazole；

Elution buffer：20mM Tris (7.9)、200mM NaCl、300mM Imidazole（咪唑浓度可根据洗脱效率进行调整）；

透析液：20mM Tris (7.9)、50mM NaCl、10%甘油；

考马斯亮蓝染液；脱色液



仪器：

Ni-NTA、超声破碎仪、层析柱、浓缩管
步骤


1、构建原核表达质粒：目的基因PCR，载体酶切，连接，转化，挑单克隆送测序；

2、将构建成功的质粒转化到BL21（DE3）中，37℃培养过夜，挑单克隆小摇过夜；

3、小诱导摸索最佳诱导条件：将摇过夜的菌液1:1000接种到3mL LB中，37℃摇4-5h至菌液OD600=0.6-0.8，加入不同浓度IPTG（0.1-1mM），不同温度下诱导，随着温度降低，诱导时间延长，如37 ℃ 诱导4-5h，30°C诱导6h-8h，16°C诱导16-20h，取不同诱导条件下诱导前和诱导后的菌液，跑胶，考染，观察诱导结果；（一般来说，IPTG浓度越低，诱导温度越低，目的蛋白表达越慢，越利于蛋白质的正确折叠从而增加其可溶性，减少包涵体的产生）；

4、找到最适诱导条件后，将菌液1:1000接种到2L的LB中，37℃摇至菌液OD600=0.6-0.8，吸出20μL菌液留待跑胶(1)，然后在预实验得到的合适的诱导条件下诱导蛋白表达，吸出20μL菌液留待跑胶(2)；

5、取出诱导后的菌液，4000g，4℃离心15min；

6、弃上清液，称重，每克菌加入10mL Lysis buffer（1:100加蛋白酶抑制剂），重悬，冰上放置约30min；

7、压力破碎：放掉高压均质仪中的酒精，用水冲两遍，用Lysis buffer平衡一遍，加入菌液，加压（压力不要超过800kpa），菌液过三到五遍至透明不粘稠；

8、收集破碎后的菌液，12000g，4℃离心20min，将上清和沉淀分离，各留取20μL样品(3)(4)待跑胶；

9、将2mL Ni-NTA加入纯化柱，待乙醇滤过，用水冲洗，加入Lysis buffer平衡柱子；

10、用Lysis buffer将Ni-NTA重悬加入上清中，混匀，4℃摇床孵育2h；

11、将上清液4℃过柱，收集滤过液20μL(5)；

12、用5mL Wash buffer洗柱子3次，收集滤过液样品20μL(6)；

13、加入1mL Elution buffer，孵育5min，收集洗脱液，重复5次，收集5mL洗脱液于同一管中，留取20μL样品(7)；

14、将实验过程中得到的各个蛋白样品跑胶，考马斯亮蓝染色1h，脱色至背景蓝色较浅，可见清晰蛋白条带；

15、分析各个样品的蛋白条带情况，根据结果进行后续操作：若洗脱蛋白样品中蛋白无杂带或杂带少且浅，可进行透析与浓缩，若杂带多则需要再次纯化后进行透析与浓缩。

16、透析：将样品加入透析膜中，两端夹紧，4℃透析过夜；

17、浓缩：根据样品分子量大小选择合适的浓缩管4℃低速浓缩，浓缩后测蛋白浓度，分装标记，在液氮中速冻，然后冻存于-80℃冰箱。