动物模型 | 溃疡性结肠炎动物模型的构建

与光同辉

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC） 是一种病因不明，波及结肠与直肠的慢性、特发性炎性肠病。据世界胃肠病学组织描述，UC在30～70岁人群中发病率基本稳定，性别间发病率也基本持平。但从整体人群而言，该病在世界范围内发病率正在不断上升，在我国等新兴工业化国家和地区这一表现更为显著。所以，需要构建合适的动物模型进行疾病的机制研究。

动物的选择


主要选择啮齿类动物，其中大鼠、小鼠是主要的实验动物。大鼠的常用品种是SD大鼠与Wistar大鼠。

造模方法


UC的主要特征表现为结肠及直肠长期反复发作的慢性炎性反应，其发病机制与机体免疫系统的紊乱和异常的免疫反应密切相关。因此，通过药物对动物肠道产生一定的化学刺激或直接损伤，模拟肠道局部的炎性反应损伤，是目前UC动物模型最常用的造模方法。



一、化学药物、异体抗原或二者联合使用



化学药物诱导是最经典且最为常用的UC动物模型建立方法。可用于诱导动物UC的化学药物种类较多。葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）、2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitro-benzenesulfonic acid，TNBS）、噁唑酮（oxazolone，OXA）以及乙酸是最为常用的化学诱导药物。



1、DSS 诱导的动物模型具有造模方法简单的特点，只需将一定浓度的DSS溶液予以动物自由饮用便可成功诱发动物结肠炎性反应，DSS可破坏动物结肠上皮细胞，损害上皮屏障功能，使肠腔中炎性物质入侵固有层及黏膜下层，以诱发动物异常的免疫反应。但DSS所诱导的动物结肠炎性反应多为急性表现，炎性反应在停药8～9d后便可恢复，这可能对开展常规研究造成一定的局限性。



而在DSS长期给药后，动物又可能出现结肠上皮萎缩，增加癌症的发生率，因此其慢性给药诱发的动物模型更适用于UC相关性结直肠癌的评价和研究。



2、TNBS作为一种半抗原，在给药时往往需要同一定浓度的乙醇溶液相混合，再通过灌肠给药。乙醇可直接对动物黏膜屏障造成破坏，而TNBS通过与大分子物质结合形成全抗原诱导免疫反应，导至促炎细胞因子释放，诱发局部炎性反应。在TNBS和乙醇的共同作用下，动物结肠炎性反应由急性炎性反应向慢性炎性反应转变，更接近于人类UC的临床表现。



3、OXA与TNBS同为半抗原药物，同样需与乙醇联用。但与TNBS不同，OXA可诱发动物Th2细胞介导的免疫反应，这与人类UC发病机制更加接近。但在造模时动物的高死亡率及病变明显的自限性导至其并未成为最广泛使用的造模药物。



4、乙酸所诱导的动物模型虽然具有操作简单、成本低廉等优势，但其诱发的动物结肠炎性反应与单纯性结肠急性炎性反应更相似，因此乙酸在对人类UC发病机制、潜力药物机制评估等方面研究并不具备优势。



二、基因敲除



随着基因工程技术的深入研究与发展，基因敲除或转基因诱导已成为一类重要的 UC 动物模型建立方法。黏蛋白2（mucin 2，Muc2）由杯状细胞分泌，是产生黏液、构成上皮屏障的重要蛋白。通过将Muc2基因敲除，导至上皮屏障缺陷，可成功诱发小鼠自发性结肠炎。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是经典的促炎细胞因子，其缺失可能导至小鼠白细胞介素（interleukin，IL）-1β 大量增加，再加之Muc2缺失诱发小鼠上皮屏障受损，可以自发诱导实验性结肠炎。



IL-10本身是一个重要的抗炎细胞因子，而小鼠IL-10基因缺失可以引起IL-10抗炎作用丧失，进一步导至结肠单核吞噬细胞介导的免疫反应，由此引发结肠炎。此外，IL-10除了作为抗炎细胞因子，还可抑制内质网应激，促进肠道黏液产生。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1，Nox1）可调控结肠杯状细胞及吸收细胞间平衡，且Nox1表达水平与肠道黏液厚度呈正相关。对小鼠IL-10和Nox1基因双敲除则可使小鼠出现与人类UC相类似的炎性反应和组织学表现。小鼠多药耐药基因1a（multidrug resistance gene 1a， MDR1a）表达与UC密切相关。MDR1a缺失会导至上皮屏障缺陷，进一步引起肠道微生物群相关产物积累，从而诱发T细胞亢进并识别抗原，产生免疫反应。



上述研究与UC发病密切相关的蛋白、因子或相关通路介质为靶点，将实验动物目标基因进行敲除，以诱导动物自发出现结肠炎性反应，因此基因敲除的动物模型适用于对关键基因导至发病机制的研究。



评价指标


采用疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分、组织病理学改变及组织病理学评分，以及结肠组织肉眼评分等指标进行判断。

1、DAI评分以实验动物的体质量、大便性状改变及隐血作为指标，在造模前后不同时间段进行评估，最终通过评分改变以判断造模是否成功，这是在 UC动物模型建立中最常用的评价指标。组织病理学改变及评分是将动物结肠组织经HE染色后，光学显微镜下观察结肠结构破坏、炎性细胞浸润等情况并进行综合评分，从而评估造模效果。这也是评价模型是否建立成功较常用的一项指标。



2、组织病理学改变及评分是将动物结肠组织经HE染色后，光学显微镜下观察结肠结构破坏、炎性细胞浸润等情况并进行综合评分，从而评估造模效果。这也是评价模型是否建立成功较常用的一项指标。



3、此外，结肠组织肉眼评分、结肠组织大体形态损伤评分 则是通过对实验动物结肠组织肉眼观察，以结肠粘连、局部水肿、溃疡形成及病变范围等为标准进行评估。

总结


当下UC动物模型仍然存在许多不足，仍然缺乏与人类UC具有高度模拟性的动物模型，而且动物模型评价系统也尚未完善。操作性强、造模成本低、模拟程度高且评价系统完善的动物模型可能成为揭示UC发病机制、探索高效治疗策略的关键工具。因此，在UC的进一步研究中，理想动物模型的探索仍需不断深入。