Pacbio单分子实时测序大观：关于琅琊榜，你不得不知道的事儿

想飞的fish

2015年最热的剧定是《琅琊榜》无疑了，业界赞誉其为“沉稳的传奇，飘逸的正剧”。而琅琊榜中最为引人瞩目的当属麒麟才子梅长苏，江湖传言“江左梅郎，麒麟才子，得之可得天下”。那么，若测序界也有琅琊榜，谁会是“麒麟才子”呢？当然是Pacific Biosystems！

一，DNA测序可以实现超过99.999%（QV50）的高度精确

第三代测序中的PacBio单分子实时（SingleMolecule Real-Time, SMRT）DNA测序可以实现超过99.999%（QV50）的高度精确测序，且不受DNA序列中GC和AT含量的影响，平均读长可达10-15kb（最长>40kb），这是如何实现的呢？这是因为SMRT技术在与DNA测序精确度相关的三个方面均有独到之处：

1. Consensusaccuracy（一致性准确性）

2. Sequencecontext bias（测序偏好性）

3. Mappabilityof sequence reads（测序reads的map表现）

另外，对于那些关注同一样本中低频率（<10%）存在的DNA分子的应用，确实是需要尽可能高的single-read准确率的，以便能进行有效区分。对于这些应用，Pacific Bioscience也开发了一种测序模式，可以在分子内进行consensus，用这种方式产生的单分子测序reads的准确率与相应读长下一代和二代测序的准确率相当，甚至是还要高。这是通过DNA模板制备时生成的SMRTbell的环状结构达到的8，这使得酶在同一个DNA环上通过不断绕圈，从而可以对同一个碱基进行多次测序。

SMRT测序是目前唯一可以生成分子内consensus的技术，即便对于样本中含量很低的DNA分子，也可以得到高精确度的碱基序列。这一能力已经被利用于检测急性髓性白血病中的低频突变9。

二，单分子实时测序，让基因组学研究霸屏顶级别期刊

随着高通量测序技术的迅速发展及成本的不断降低，物种全基因组测序项目从最初耗时10年并花费几十亿美元的人类基因组计划到现在仅需几个月、花费几百万甚至几十万即可完成。因此，物种全基因组测序项目已成为众多实验室或研究者的首选课题。

自2013年3月至今已有三四十个物种的基因组测序成果相继发表，但文章的档次良莠不齐，有的项目同时在Nature杂志上发表两篇文章，而有的项目只发表影响因子为10以内的文章，通过过去几年PacBio技术的发展，单分子实时测序技术已能得到微生物基因组完成图(真菌基因组近完成图)，更参与了大型基因组的升级和de novo组装，为基因组组学研究霸屏顶级别期刊添砖加瓦。

1，         大猩猩再次登上Science头条

Long-read sequenceassembly of the gorilla genome. SCIENCE (2016)

2，         耐旱草  复杂基因组元件蕴藏着什么样的宝贵信息?

Single-moleculesequencing of the desiccation-tolerant grass Oropetium thomaeum. Nature(2015)

3，         扁虫为何可以再生

Genome andtranscriptome of the regeneration-competent flatworm, Macrostomum lignano. PNAS （2015）

三，单分子实时测序技术在微生物鉴定方面种属分类信息可靠度会更为精确

利用PacBio RS II三代测序平台，可以无需PCR扩增，实现完全意义上的单分子扩增测序。三代平台的PacBio RS II的平均读长为10-14Kb，16S rDNA长度大约为1500bp左右，因此结合该平台测序可以成功测序获得16S的全长序列,这样在微生物鉴定方面种属分类信息可靠度会更为精确。

番外篇 关于天津生物芯片

2013年天津生物芯片国内率先提供PacBioRS II三代测序服务，天津生物芯片已积累丰富的项目经验，目前应用该平台产出的各项结果均在国内遥遥领先。其中，测序读长可达42Kb，readsN50高达18Kb，每个SMRTCell的数据量最高达1.4Gb。

天津生物芯片通过三代测序生物信息学工具和流程的开发，解决了复杂基因组组装、微生物完成图组装、全长转录组分析、人类基因组变异检测等领域的技术瓶颈，推动了基因组学研究的升级换代，目前已经完成数百个三代测序科研项目，成为中国三代测序技术应用的领跑者。

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好好学习一下