匆匆这几年,Pacbio 测序带领我们探索的未知（二）

想飞的fish

3全长转录本 Iso-Seq测序

基于PacBio SMRT单分子实时测序技术的全长转录组测序无须打断RNA片段，使用RACE技术反转录得到的全长cDNA。该平台的超长读取（median 10kb）包含了单条完整转录本序列信息，后期分析无需组装，所测即所得。其测序结果可直接用于后续的Isoform、同源基因、基因家族、等位基因、可变剪接、lncRNA等分析。引导人们更深层次的理解位于中心法则中心地位的这一生命活动，另外还可用于对所在基因组的注释升级，完善基因组数据库。

     2013年10月的Nature biotechnology上斯坦福大学的Sharon等用PacBio对人的20个不同组织样本未打断的转录组进行了测序，通过比较分析，发现CCS reads大部分为全长转录本序列，且无论是长度还是reads质量以及转录本完整性等方面都要远远优于454测序结果。共鉴定出了约14000个spliced GENCODE genes，超过10%的部分有新的结构，而比对到未注释区域的转录本有相当一部分具有lncRNA的特征。结果有力的证明了PacBio对复杂真核生物进行全长RNA分子深度测序的可行性。

天津生物芯片借鉴《PNAS》文章将Illumina与PacBio的测序技术结合起来解决异构体鉴定和定量的成功经验，将我司第三代测序平台PacBio RS II用于 RNA-seq ，可以直接得到从5’端到3’端的高质量全长转录本信息，转录组不再需要组装，所测即所得。同时结合第二代测序低价格、海量数据、高准确率读长等优点，从而高性价比地得到基因的全长isoforms序列，同时使得isoforms定量更加可信，大大缩短后续的应用分析时间。

4 复杂遗传病的研究

（1）利用新的基因组测序技术，研究人员揭示出了人类基因组中从未见过的遗传变异

2014年11月10日的《自然》（Nature）杂志上。该文利用PacBio单分子实时测序测序技术，揭示出了人类基因组中成千上万从未见过的遗传变异。这些研究发现关闭了长期以来因无法测序造成的许多人类基因组作图缺口，这一发现被业界评论为首次构建了白金人类基因组！

领导这一研究小组的是华盛顿大学基因组学系教授、霍华德•休斯医学研究所研究员、弗雷德•哈钦森癌症研究中心人类生物学部兼职教授Evan Eichler博士，其主要从事于基因组学与生物信息学研究，是国际上进行人和其他灵长类动物比较功能基因组学与生物信息学研究的顶尖科学家。Eichler说：“长期以来科学家们对许多疾病的遗传病因都感到困惑不解。这一称作为单分子、实时DNA测序(SMRT)的新技术，使得研究人员现在鉴别出这些疾病背后的潜在遗传突变成为了可能。现在，我们进入到了以往对我们来说不透明的一个遗传变异的全新领域。”

这一由生物研究公司Pacific Biosciences of California Inc开发的“长读”技术，使得研究人员能够构建出相比以往更高分辨率的基因组结构变异图谱。研究的主要作者、Eichler实验室博士后Mark Chaisson开发出了这种方法，使得利用这一数据以碱基对分辨率来检测结构变异成为了可能。

（2）PacBio用于HLA分型研究优势明显

HLA分型，人体器官移植中，准确的HLA分型很重要。HLA是一个长片段，而且单体型对配型成功、移植成功有重要意义。现在医学上正在尝试用PacBio的序列来为HLA准确分型提供解决方案。

2015年5月，《PLOS One》刊登了安东尼·诺兰研究所科学家的一项可行性研究。该研究取两例血液样本，两例唾液样本及三例已知HLA分型的细胞系样本，通过PacBio RS II对样本进行单分子实时测序，获得3个HLA-I等位基因全长序列，每个基因测序深度达到150X。同时，研究人员还运用了Luminex LABType序列特异性的寡核苷酸分型试剂盒对上述样本进行了分型。该研究还发现了4个新的HLA等位基因，并通过了Sanger测序验证。

研究结果显示，单分子实时测序技术可以很好地应用于高通量HLA分型中。研究人员在文章中强调，相比于其他测序平台，该技术能够对同聚体域进行更精准的测序。