匆匆这几年,Pacbio 测序带领我们探索的未知（一）

想飞的fish

          PacBio测序仪是Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time,SMRT），DNA测序是在SMRT Cell中进行的，其专利SMRT Cell含有15,000个纳米级的零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs），每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。该平台无需扩增即可直接对单个分子进行测序，有效避免了PCR扩增偏好性及GC偏好性。同时，可利用测序过程聚合酶反应的动力学变化首次实现对碱基修饰进行直接测序，适合传染病、微生物、农业和复杂遗传病的研究。

1动植物全基因组de novo测序

（1）鳕鱼

    鳕鱼基因组（830 Mb）测序项目启动于2008年，由CEES的科学家牵头，早期投入是在454平台上用shotgun和mate-pair测序以及基于BAC的Sanger测序法，但早期组装结果非常不理想，Contig十万个以上，Scaffold上千个，平均每个Scaffold中35%都是Gap，于是他们被迫选择了Pacbio第三代测序。当我们把PacBio数据导入到之前的Draft中去后，大片段甚至是Kb以上级别的Gap就神奇地消失了，我们之前几年的辛苦在这里瞬间完成了，我们遇到的STR和杂合性问题也迎刃而解了。“我们之前从没见过如此之快的组装速度，全程才用了36小时。”

（2）仿刺参

中国科学院海洋研究所在天津生物芯片的技术支撑下，突破了刺参复杂基因组测序和组装技术瓶颈，采用新一代测序技术获得132gb高质量dna序列数据，覆盖全基因组160倍。科研人员利用针对高复杂度基因组组装的创新策略，在国际上首次成功完成了野生刺参的基因组组装，目前获得的框架图总长度达到765mb，组装叠连群contign50达112kb，该数值优于国际迄今已发表的多数水产动物基因组图谱的指标。

（3）某二倍体植物

     某二倍体植物基因组大小为350M左右，且杂合度比较高。天津生物芯片使用P6-C4试剂组合，进行上机测序，测其全基因组DNA。最终测得subreads的总数据量为30.4Gb，经过过滤的subreads长度的N50值为15,450bp，subreads的平均长度为11,054b。采用TBC研发的拼接策略仅用Pacbio进行denovo拼接，最终获得了321Mb基因组序列，最终拼接结果的Contig N50值达到1.35Mb。

2微生物基因组测序

    (1) 真菌

Oklahoma州立大学和Oklahoma大学的科学家联手研究独黑粉菌基因组，该真菌以厌氧状态寄生在大型家畜的胃肠道中，负责降解植物类材质，该研究有望揭示并合理利用降解功能基因，最终发表在ASM journal Applied andEnvironmental Microbiology，标题为The Genome of the Anaerobic FungusOrpinomyces sp. Strain C1A Reveals the Unique Evolutionary History of aRemarkable Plant Biomass Degrader。经分离的C1A菌株拥有大型真菌基因组，超过100Mb，共16000个以上的编码基因。这项研究的难点是，C1A菌株的GC含量超低，仅17%，可以说是他们见过的GC含量最低的物种。不仅如此，这个菌株还有一个非常罕见的特征，即基因间的非编码区域非常大，占据了73%，里面大量SSR，占整个基因组5%的比例，可以说是他们见过的最复杂的真菌。

研究人员最开始基于Illumina的Paired-End技术，测了290X覆盖度，但组装效果非常糟糕，Contig数为82325个，N50仅为1666bp，而且其中32.4%都是长度仅300-900的短Contig，于是他们只好加测了10X覆盖度的PacBio数据，最终使QV值达到59.7，即准确率接近99.9999%。“最终的组装结果使N50/N90获得了不可思议的提升，特别是发现了大量之前在Illumina结果中丢失的内含子信息，其中主要都是SSR。”参与研究的 Mostafa Elshaheda教授说道。

有了接近完整图的基因组信息后，研究人员进行了下一步的功能性研究。他们发现C1A菌株是个令人非常震惊的生物降解器，对植物材质的适用性非常广泛，比如对柳枝、 玉米秸、 苜蓿等这些性质不同的植物都可以降解，几乎所有他们尝试的植物都可以适用，这一特点使得C1A有望应用到生物燃料生产中去。

      (2) 细菌

PacBioRS II测序系统无需PCR的建库技术，大大减少了高GC基因组所带来的偏好影响；领先的超长测序，reads 读长10-14kb，有效提高基因组组装精准度和完整性，可更精确检测基因组变异及修饰情况，更适用于微生物基因组研究。

美国国立卫生研究院（NIH）和Pacific Biosciences的研究人员利用PacBio的单分子实时（SMRT）测序技术，解析了与肠杆菌（Enterobacteriaceae）相关的医院获得性感染中质粒介导的抗生素耐药性。这项成果发表在2014年的《科学-转化医学》上。

最近几年，美国频频出现“超级细菌”感染。当研究人员筛查超过14,200个患者样本及数百个从医院环境中采集的样本时，研究小组追踪到10名患者，携带了包含KPC阳性质粒的肠杆菌。还有两名患者在出院后被检测出KPC肠杆菌呈阳性。

研究人员之前试图利用短读取（short-read）测序技术对含有KPC的质粒进行测序和追踪，但遇到了一些问题。Segre解释道，部分原因在于含有抗性基因的质粒往往含有大的、移动的遗传元件。

她指出，以这项研究中的碳青霉烯耐药性质粒为例，KPC基因的两侧伴有Tn4401转座子，伸出去多达10,000个碱基。因此，在试图鉴定每个细菌细胞中的多个质粒时就面临挑战。为了解决这个问题，研究人员决定利用PacBio的RSII系统来产生单分子的长读取，这让他们能够同时查看细菌基因组的序列和质粒的序列。

     利用这种方法，他们对2012-2013年鉴定出的12名KPC阳性患者的分离株进行了测序，同时对2011年爆发期间采集的2个分离株和医院内的6个环境监控样本进行了测序。