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[求助] taqman探针的荧光基团和淬灭基团的问题

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发表于 2015-1-6 12:49 | 显示全部楼层 |阅读模式

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关于taqman探针的荧光基团和淬灭基团,我一直有以下疑问:
1、为什么荧光基团标记在5端,淬灭基团标记在3端,能不能反过来?
2、能不能两个集团标记的近一点,比如,荧光基团标记在5端,淬灭基团标记在中间dTNP上?
期待高手指点。
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 楼主| 发表于 2015-1-21 10:23 | 显示全部楼层
      目前这个问题挂了好久了,还没人回答我,期待关注,期待高人指点迷津,有时候不弄清楚这些问题,心里不踏实。
      针对于第一个问题,我还是没有看到更好的文献支持,我还没看到Taqman realtime-PCR最初的专利,希望有人能提供,应该在专利中有解答,目前还是存在疑问,自己没有尝试过这样做,所以还是有疑问;
      第二个问题,现在有一点点儿明朗了,看到一些将淬灭基团标记在探针中间位置的dTTP上设计,也看到过一些商家提供这样的标记选择,我想应该是没有问题,但是还有一点疑问就是,如果真的没有问题的话,那为什么主流的选择是标记在3端,难道仅仅是为了阻止探针扩增吗?所以还是期待高人进一步指点。
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 楼主| 发表于 2015-1-23 09:20 | 显示全部楼层
这两个问题很显然不是我们日常考虑到的问题,但是一定是方法建立时发明人考虑的问题,因此我特意的查询了相关专利和文献,也确实找到了一些蛛丝马迹,因此自问自答一次,希望给有同样疑惑的同仁们一些解答吧。
第一个问题:我的理解是这样的,两个基团互换,原则上应该没有大的影响,但是我们采用的Taq酶是利用5-3外切酶,我们常见的思维是优先标记5端,这样优先被切割掉,有利于荧光信号的释放,早期的研发专利荧光基团和淬灭基团都标记在5端或近5端,如果查看专利US7205105等MGB相关专利的话,发现一度出现淬灭基团是标记在5端,荧光基团是标记在3端的探针。所以对于这个问题,不需要再深究了,就好比通往目的地有两条平行的路,我们选择了走其中一条,然后我们问为什么不走另一条路是一样的问题。
第二个问题:这个问题可以参考两篇文献:《Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization》、《Design and Synthesis of Fluorescence Energy Transfer Dye-Labeled Primers and Their Application for DNA Sequencing and Analysis》,在第一篇文献中,作者研究了淬灭基团在不同位置对结果的影响,研究发现,标记在3端末端信号与标记在中间7-27等位置几乎没有显著差异,作者认为没有差异的原因是单链探针的结构的柔韧性(flexibility),所以双标记探针标记在两个顶端最好方案,第二篇文献,作者研究了淬灭基团分别标记在距荧光基团1、2、3、4、10碱基的位置,研究发现距离10个碱基位置效果最佳。目前供应商也提供标记在中间的服务,价格较贵一点点儿,工艺上也困难一点,因此普遍采用的是目前的做法。
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发表于 2016-3-29 10:01 | 显示全部楼层
受教了,赞一个!
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发表于 2017-4-19 16:54 | 显示全部楼层
赞一个,也受教了
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发表于 2018-5-31 15:15 | 显示全部楼层
谢谢分享
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发表于 2018-10-17 15:34 | 显示全部楼层
厉害、厉害
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发表于 2022-8-15 14:50 | 显示全部楼层
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