核酸质量评估详解

核酸质量评估是分子生物学和生物技术领域中一项重要的步骤，主要用于确认提取的DNA或RNA是否适合后续实验(如PCR、测序、克隆等)。以下是核酸质量评估的几个关键方面：

核酸分子中的碱基(嘌呤和嘧啶)在紫外光区，特别是在260nm处，具有强烈的吸收特性。通过测定核酸溶液在260nm处的吸光度(A260)，并应用朗伯比尔定律(A=εcb)，可以计算出核酸的浓度。该方法广泛应用于分子生物学实验中的核酸浓度测定，包括PCR产物分析、质粒提取效果评估、RNA提取质量检测等。

通过测量260 nm处的吸光度来估算核酸的浓度：

DNA浓度计算：A260 × 稀释倍数 × 50 µg/mL。

RNA浓度计算：A260 × 稀释倍数 × 40 µg/mL。

荧光光度法基于荧光染料与核酸分子结合后产生的荧光信号进行测定。荧光染料(如SYBR Green、PicoGreen等)在特定波长的光源激发下能发出荧光，荧光强度与核酸分子的数量成正比，通过测定荧光强度，可以定量核酸的浓度。荧光光度法广泛应用于微量核酸的定量检测，如用于基因表达分析、病毒载量监测、基因组学研究等领域。

虽然该方法比吸光度分光光度法更昂贵，但此法对目标样本更灵敏、更精确并且可能具有特异性，适合微量和低浓度样本。目前常用的仪器如Qubit:

通过定量PCR检测样品中是否存在残留的蛋白质或其他抑制剂。高纯度的样品应在PCR反应中表现出良好的扩增效率和较低的Ct值。

荧光定量PCR法通过在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，实时监测荧光信号。随着PCR反应的进行，荧光信号积累并达到阈值(Ct值)，该Ct值与起始模板浓度的对数呈线性反比关系，利用Ct值和标准曲线，代入回归方程，计算出样本的核酸含量。该方法广泛应用于基因表达定量分析，病原体检测与鉴定，遗传病诊断，药物研发等领域。通过定量PCR检测样品中是否存在残留的蛋白质或其他抑制剂。高纯度的样品应在PCR反应中表现出良好的扩增效率和较低的Ct值。

使用紫外分光光度计测定核酸样品的吸光度比值是最常见的方法。通常测定的是260 nm、280 nm和230 nm的吸光度。

A260/A280 比值：用于评估蛋白质污染。纯净的DNA样品比值在1.8-2.0之间，RNA样品则在2.0左右。如果比值低于这些范围，说明有蛋白质污染。

A260/A230 比值：用于评估其他有机物或盐的污染。纯净的核酸样品比值应在2.0-2.2之间。如果低于2.0，可能存在多糖、酚类或盐类污染。

这是评价核酸样品完整性和降解情况的常用方法。样品电泳后，根据条带的清晰度和完整性来判断核酸的质量。如电泳后点样孔较亮甚至点样孔与目标带之间有明显拖尾现象，说明杂质(例如蛋白质)残留较多。如在4kb-5 kb甚至再高分子量处出现条带，说明有明显DNA残留。

DNA电泳：完整的基因组DNA应表现为一条高分子量的条带，无明显拖尾。

RNA电泳：完整的RNA样品应显示出清晰的28S和18S rRNA条带，28S条带的强度应约为18S的两倍。

• rRNA Ratio [28S/18S]:1.8~2.0表明所提取RNA完整性较好，基本无降解发生;

• 28S / 18S比值>1.5：高质量RNA;

• 28S / 18S比值1.3-1.5：部分RNA降解，勉强可用;

• 28S / 18S比值<：质量较差RNA。

凝胶电泳法是一种不敏感的检测样品完整性的方法，需要大量的样品，不适合少量样本的评价。另外，这种方法依赖于人工对凝胶图像的解读，因此较为主观，难以进行实验室之间的比较，并且得到的数据难以进行数字化处理。

利用微流体芯片技术，对核酸样品进行高分辨率电泳分析。Bioanalyzer能精确地测定样品的RNA完整性(RIN值)或DNA片段大小和浓度，特别适合高通量检测。依据RIN值可对RNA的完整性进行评分，RIN值越高,代表RNA的完整性越好。

如Agilent旗下的bioanalyzer仪器，使用RNA Integrity Number (RIN) 对RNA完整性进行评估，直观地判断出RNA样本的降解程度。

RIN值范围为1~10，不同数值代表着样品RNA的不同降解程度，通常，RIN值越高，表明RNA质量越好，则二代测序的数据质量也越高;

RIN值>7,：高质量RNA;

RIN值6-7：部分RNA降解，勉强可用;