一文读懂二代测序（NGS）

背景与历史

• 启动时间：1990年，目标是绘制完整的人类基因组序列。
• 完成情况：2003年完成了85%的基因组序列，2022年完成了所有缺失片段的填补。
• 历时：32年完成了完整的人类基因组测序。
• 技术对比：最初使用的是Sanger测序技术，一次只能测序一条DNA链。而NGS技术可以同时测序数十亿条DNA链，大大提高了速度。
  NGS的诞生与发展：
• 通过NGS技术，测序一个人的全基因组只需一天，显著缩短了测序时间。
• NGS技术依赖于人类基因组计划创建的参考基因组。

NGS的原理与步骤

样品处理

• 样品收集：收集目标DNA或RNA样本。
• DNA/RNA纯化：提取并纯化样品，确保样本纯净且无降解。

• RNA逆转录：如果目标样品为RNA，需通过逆转录将RNA转化为cDNA（互补DNA），才能进行后续的DNA测序。

  
  

  

文库构建

• DNA片段化：
• 使用高频声波或酶将长链DNA切割成短片段。
• 片段的长度根据应用需求进行特定控制。
• 添加适配子（Adapters）：
• 适配子是添加到每个DNA片段两端的短DNA序列。
• 这些适配子包含了测序仪器所需的序列信息，还包含样品标识（Index），用于区分不同的样本。
• 文库纯化与扩增：
• 通过磁珠等方法去除未结合的适配子，保证文库的质量。
• 根据具体应用，可能加入PCR扩增步骤来增加文库的量。
• 一个成功的文库需达到指定的片段长度和足够的浓度，才能进入下一步测序。

测序准备与合成

• 流动池表面准备：
• 测序发生在玻璃表面的流动池（Flow Cell）中，流动池表面附有与文库适配子序列匹配的寡核苷酸（Oligonucleotides）。
• 文库加样与变性：
• 将文库片段通过变性（Denaturation）处理，转变为单链DNA。
• 单链DNA与流动池表面的寡核苷酸结合，形成DNA链。
• 克隆扩增（Clonal Amplification）：
• 使用PCR技术对文库片段进行扩增，以便形成簇（Cluster），增加荧光信号的强度。
• 过程：DNA链通过桥式PCR扩增，形成多个拷贝（双链DNA），然后将双链分离，重复此过程形成大量局部簇。最终切割掉反向链，留下前向链用于测序。

测序过程

• 测序合成（Sequencing by Synthesis, SBS）：
• 原理：测序时通过DNA聚合酶将荧光标记的核苷酸（A、T、G、C）依次加入待测DNA链中，每次加入一个碱基，荧光信号被相机捕获和记录。
• 每种碱基（A、T、G、C）带有不同颜色的荧光标签和终止子，确保每个循环只能加入一个碱基。
• 测序步骤：
1. 加入带荧光标签的核苷酸，碱基配对。
2. 相机记录每个簇的荧光信号（颜色）。
3. 去除终止子，继续加入下一个核苷酸，重复此过程，直到完成预设的测序长度。
• 指数读取：
• 指数（Index）测序：通过标识序列区分不同的样本。
• 多重样本测序：利用独特的双重指数标签，最高可同时在一个流动池中处理384个样本。
• 双端测序（Paired-End Sequencing）：
• 双端测序生成两个来自同一片段的读取（一个来自前向链，一个来自反向链），增加了测序的准确性，尤其是长片段分析。
• 过程：前向链测序完成后，创建桥接结构使反向链成为模板，接着对反向链进行测序。

数据处理

• 质量控制与过滤：
• 在测序完成后，过滤掉质量较差的读取，如重叠的簇、强度过低的簇，以及多重簇的情况。
• 去重与解复用（Demultiplexing）：
• 利用样本指数（Index）将不同样本的读取分离。
• 比对与组装：
• 将过滤后的读取比对到参考基因组上，重组DNA片段，并通过算法识别和定位这些片段。
• 深度与覆盖度：
• 读数深度（Read Depth）：指某个核苷酸被测序的次数。常规全基因组测序需要30倍的平均读数深度，癌症研究中检测稀有突变时需要更高的读数深度（如1500倍）。
• 覆盖度（Coverage）：目标是确保测序过程中目标区域没有遗漏，覆盖率越高，数据越完整。

参考文献