熔解曲线技术-进阶篇

在上一篇中主要介绍了熔解曲线技术的基础框架（戳：熔解曲线技术-基础篇），在本篇中介绍相关的扩增方式、探针类型、降低非特异性的方法和异质性突变富集的方法。本篇文章文字较多，请耐心观看。

一、扩增方式

扩增方式一般有两种，对称扩增和不对称扩增。

1、对称扩增

使用等量的引物进行PCR扩增，扩增产物量随着PCR循环呈指数增长，一般的PCR，使用的都是这种方式。

由于TaqDNA聚合酶具有5’-3’外切酶活性，在PCR扩增的过程中会水解探针，导至探针被耗尽，无法用于熔曲分析；若使用抗酶切修饰的探针，可一定程度降低水解，但由于探针阻碍了聚合酶通过，扩增效率会大幅下降。

对称扩增产生的互补双链，会与探针竞争结合靶序列，不利于探针结合到靶序列上，熔曲分析可能会出现异常。

优点：灵敏度高

缺点：一般搭配使用媒介探针进行检测，而其他类型探针由于被切割而无法使用（宝创的MPA技术另辟蹊径，后续会进行讲解，敬请期待）

2、不对称扩增

上下游引物中，有一条引物为过量使用，一条引物限量使用，在PCR扩增的前期，扩增产物量呈指数增长，待限量引物耗尽，扩增产物量呈线性增长，产生大量的单链用于探针的结合和熔解曲线分析。

LATE-PCR方法中，由于考虑到引物浓度对引物Tm值的影响，限量引物由于浓度低，对模板的结合效率下降，从而影响不对称扩增前期的扩增效率，因此对限量引物的Tm值进行了增加（即加多几个碱基）。

优点：不会消耗探针，探针可用于后续熔解曲线分析

缺点：灵敏度低，一般用于基因检测，不适用于病原检测（病原检测需要高灵敏度）

二、探针类型

1、双标记自淬灭探针

双标记自淬灭探针是一条两端分别标记荧光基团和淬灭基团的单链寡核苷酸。

优点：1、检测熔点温度范围宽，与不完全匹配的靶序列也能够杂交，产生较低的Tm值，其杂交熔点温度可低至40℃~45℃。较宽的熔点温度检测范围可满足自淬灭探针在同一检测通道区分更多的靶序列；2、探针设计简单、自由度高。

双标记探针在基因检测中的应用

基因检测，一般采用LATE-PCR不对称扩增方式，形成大量单链模板用于熔解曲线分析。

点突变：当检测模板为野生型时，形成特定Tm值的熔解峰；当检测模板为突变型时，由于探针与模板存在错配，结合能力下降，会在低Tm值处形成熔解峰，野生型和突变型得以区分识别。

片段缺失：当检测模板为野生型时，形成特定Tm值的熔解峰；当检测模板为片段缺失时，由于探针无对应的特异性结合位点，不能形成特定Tm值的熔解峰。

双标记探针在病原体检测中的应用

此类型探针在病原检测中较为特殊，病原检测需要采用对称扩增，会将探针水解掉，在检测的过程中需要配合其它策略才能进行检测，具体详见宝创的MPA技术，后续会对其进行讲解。

2、分子信标探针

分子信标探针是由与靶序列特异性结合的环序列和与靶序列无关的臂序列组成的茎环结构，并且臂序列两端分别标记荧光基团和淬灭基团。当其为游离状态时，由于茎区序列互补配对，淬灭基团与荧光基因相互贴近，荧光基团无法发出荧光。而当信标探针与模板中的靶序列相结合，发夹结构展开，淬灭基团与荧光基因分开，发出荧光。

优点：茎结构稳定，淬灭基团与荧光基因相互贴近，背景荧光信号较低；

缺点：自身二级结构较稳定，对于低温Tm值的探针较难设计。

改良分子信标：与模板特异性结合靶序列互补的序列延伸到臂上。

优点：，具有更高的杂交效率；

缺点：不同的靶序列具有不同的茎序列，增加了探针设计的难度。

3、媒介探针

媒介体系由媒介探针和通用荧光探针构成。以厦门大学的MeltArray技术为例子，其通用探针为分子信标（Seegene公司的TOCE技术的通用探针则采用双标记自淬灭探针）

媒介探针由一段与任何靶序列都不杂交的序列（媒介子）和靶特异序列组成，探针的3’端进行封闭修饰，阻止其延伸。

反应原理：

a.媒介探针的靶特异序列特异识别模板DNA序列，并与之互补杂交，而媒介子序列由于不与模板DNA互补，因而会翘起；

b.DNA聚合酶延伸过程中，其5’→3’端外切酶活性的作用下，媒介子会被酶切下来；

c.酶切游离出来的的媒介子与通用荧光探针环上的某段序列互补杂交，在DNA聚合酶的作用下，以通用荧光探针为模板进行延伸，置换出3’端茎序列，荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光；

d.不同媒介子在通用荧光探针环序列上的结合位置不同，从而产生不同长度的扩增子，当进行熔解时，不同长度的扩增子解链的熔点不一样，就能形成不同的Tm值；

e.不同检测对象对应不同的媒介子，再引入不同荧光标记的通用探针，就能产生不同通道不同温度的熔解峰信号，从而达到不同病原体的区分。

优点：1、引入多色检测，通过Tm值的差异，提高了检测通量；2、减少荧光通用探针的数目，实现高通量检测的同时也降低了成本；3、不会因为SNP位点而导至熔解分析过程中Tm值的偏移；4、对媒介子和通用荧光探针开发设计完后，可重复使用，后续其他试剂盒的开发难度变低

缺点：媒介子和通用荧光探针的设计需要进行前期开发摸索

媒介探针在点突变中的应用

在检测突变的应用上，可分为酶切法和杂交法，此应用更多为科研型，小编个人不建议应用到检测试剂的开发中，仅作为学习扩充。

a.酶切法

媒介子3’末端的最后1个碱基与突变碱基完全匹配，该碱基所在位置为酶切位点。当媒介探针检测突变模板时，酶切位置在该碱基5’端，该突变碱基保留在靶特异结合序列上，被切下来的媒介子与通用探针完全互补配对，结合延伸后发出荧光，并在熔解程序时产生熔解峰；当媒介探针检测野生模板时，酶切位置在该碱基3’端，该突变碱基保留在媒介子上，被切下来的媒介子与通用探针互补配对，由于3’端不匹配，所以媒介子无法延伸，结果无熔解峰产生。

此法选择的DNA聚合酶应无校正活性（3’-5’外切酶活性）。

b.杂交法

媒介探针按照突变模板设计，将突变位点尽量放在靶结合序列的中间位置，以增加媒介探针与野生模板杂交的Tm值差异，媒介探针与野生模板结合的Tm值低于退火温度，使得媒介探针和野生模板在退火阶段不能杂交，导至媒介子无法被酶切割和延伸而无熔解峰产生，相反，突变模板能产生熔解峰。

探针设计要点：序列较短，特异性强，保证媒介探针与野生模板结合的Tm值低于退火温度；可对突变位点进行LNA修饰，以增加Tm值差异，使媒介探针与突变模板结合的Tm值高于退火温度。

4、双杂交探针

双杂交探针也叫FRET 探针，由两条相邻并与靶序列互补的寡核苷酸探针组成，上游探针的3’端标记荧光基团，相邻下游探针的5’端标记淬灭基团，3’端进行封闭修饰，阻止其延伸。

在PCR的复性时，当存在靶序列时，两探针同时结合在模板上，不发出荧光，熔融阶段，探针从模板上解离下来，荧光基团和淬灭基团远离，发出荧光，最终形成熔解峰；当无靶序列时，荧光不变，最终不形成熔解峰。

优点：需要两条探针同时结合才能正常检测，特异性高

缺点：需要设计两条探针，成本和设计难度均增加，两条相邻的探针设计需要较长的保守区域

三、如何降低非特异性扩增

1、HANDS技术（Homo-Tag Assisted Non-Dimer System，同源加尾无二聚体系统）

通过对引物添加标签，当形成引物二聚体后，由于首尾的序列互补，会形成发夹结构，不再作为模板进行扩增。

2、DPO引物（Dual Priming Oligonucleotide，双启动寡核苷酸）

DPO引物主要由三个部分组成，长的 5'端片段、短的3'端片段、中间起连接作用的聚脱氧次黄嘌呤(poly I)。由于脱氧次黄嘌呤与天然碱基结合较弱，因此相当于与模板DNA形成了一个气泡结构。

即使DPO引物的较长的 5'端部分结合到了非靶序列部位，但由于热力学限制，3’端部分阻止了非特异结合并有效地阻断了延伸。同样由于热力学限制，单独的3'端部分在PCR退火温度下不能结合到靶序列上。从而减少引物二聚体的扩增。

3、touch-down技术

即降落PCR，在退火阶段，采用逐级降温的方式，能有效减少非特异性扩增。温度较高时，由于非特异性结合的结合力较弱，不利于非特异性扩增，特异性扩增占优势。

以上3种方法，是借鉴同类产品采用的方法，除了这些，还有很多减少非特异性扩增的策略和方法，后续小编会单独出一期进行详细讲解。

四、耐药突变的富集

异质性耐药是指在一份患者样本中，同时存在敏感菌和耐药菌，敏感菌和耐药菌的比例不等。在治疗过程中，耐药菌逐渐成为优势菌群，超过一定比例的耐药菌即可引起临床反应性下降。比如结核分枝杆菌，当异质性耐药样品中的耐药菌比例超过1%，临床上的化学治疗就很可能无法达到预期效果。因此，在大量敏感菌的背景下检测出少量的耐药菌具有重要的临床意义。

该方法需要设计1条探针，探针与野生模板完全匹配并稳定结合，而不与突变模板结合。在PCR延伸阶段，探针与野生型模板紧密结合，阻碍了引物的延伸。而对于突变模板，探针不与其结合，引物得以继续延伸。探针选择性地阻碍了野生型模板的扩增，从而富集了突变型模板。

为了避免荧光探针在延伸阶段被DNA聚合酶水解，可以使用无5'-3'外切酶活性的KlenTaq-S DNA聚合酶，或者对探针的5’端进行修饰，以抵抗酶的水解。

今天先讲到这里，感谢大家耐心看完，后续为大家介绍不同厂家所采用的检测技术，敬请期待！