问题6 采集到质量较差的谱图时，如何分析原因？
推荐意见6 推荐采用新鲜菌落进行MALDI-TOF MS鉴定，针对不同病原微生物的特征，选择恰当的前处理方法提高谱图质量。
合格的谱图应包含丰富的谱峰信息，体现在峰数量较多且分散、强度错落有致、分辨率较高、信噪比较高。在日常工作中，如果质控正常，采集到的谱图质量仍不理想，可能的原因如下 ［ 3 ， 6 ］ 。
标本因素：（1）建议使用新鲜的菌落进行鉴定，此时微生物处于指数生长期，有利于采集到优质谱图；随生长时间延长，菌龄增加，影响谱图质量 ［ 42 ］ 。（2）肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、隐球菌等黏液型菌落，由于细胞壁外有荚膜，导至破壁困难，鉴定性能下降 ［ 18 ］ ，建议使用棉签拂去菌落表面黏液，再挑取下层菌落进行点靶。
前处理操作：若前处理方法选择不当，导至细胞壁破碎效果差，蛋白质释放不足，容易出现杂峰干扰、峰数量少、信号低等问题。
点靶操作：因操作者手法问题造成点靶质量差，常见于以下几种情况（ 图3A~3D ）。（1）菌量过少（ 图3B ）可能造成谱图信号弱。（2）菌量过多（ 图3C ），涂靶过厚，容易造成谱图分辨率差、质量轴漂移等现象。（3）涂靶不均匀（ 图3D ），自动采集过程中容易采空，或者厚薄不均造成结晶分布不均，影响激光激发效果，重复性差。（4）培养基成分干扰，挑取菌落时混入培养基，涂靶后鉴定容易受到培养基峰的干扰。
图3 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱点靶效果示意图（3A示菌量适宜，3B示菌量过少，3C示菌量过多，3D示涂靶不均匀）
问题7 当谱图质量合格但鉴定结果不理想时，如何分析原因？如何确定处理方法？
推荐意见7 当谱图质量合格但鉴定结果不理想时，推荐通过校准/质控排查仪器原因，观察菌落排查标本混合菌、污染等原因，最后考虑数据库的局限性，可用自建库进行改善。
仪器原因：质量轴发生偏移，可能的原因包括未进行校准或校准不当、靶板平整度不合格、结晶不理想及其他仪器系统原因等。可通过在靶板不同区域进行质控/校准菌株的鉴定操作快速排查。当校准/质控未通过或不同区域质量轴差异较大时，需保证靶板的平整度，并及时对仪器进行校准。
标本原因：（1）混合菌或者培养物被污染。如果标本在质谱鉴定前未获得纯菌落，谱图中可能含有多菌种谱峰信息，导至鉴定失败。建议重新挑取纯菌落，或者重新通过分纯培养获得纯菌落。（2）标本间交叉污染。操作不当导至的交叉污染，如靶板清洗不充分、不同靶点之间枪头混用、标本溢出靶点等，可能导至谱图信息混杂，影响鉴定结果。建议规范操作并按照说明书正确清洗靶板。（3）培养条件不同。当待测株与建库株的培养方法不一致时，可能鉴定失败。如部分丝状真菌在不同的培养基类型、培养天数、温度等条件下，可能会对谱图产生较大的影响 ［ 21 ， 43 ］ 。
数据库原因：（1）数据库菌种覆盖度不足。如果数据库中未包含待测菌株的菌种参考谱图，则无法正确鉴定。（2）待测菌株与数据库中同种菌株差异较大。虽然数据库中包含待测菌种，但由于亚种、地域、标本来源、是否产黏液等因素导至的同种菌株之间差异性，鉴定结果可能不理想。
问题8 单个标本重复鉴定出现不同的鉴定结果，如何解读结果及处理？
推荐意见8 单个标本重复鉴定出现不同结果，多是由于鉴定未到种水平所致。可能匹配质谱易混淆的近缘菌种，也可能是由于分辨率不足/数据库菌种缺失导至的匹配到多个低置信度的同属不同种，如有必要需重新制样或进一步补充其他方法进行区分。
多次采集/多点采集鉴定出现不同结果，考虑以下原因和相应处理流程。
近缘菌种易混淆：MALDI-TOF MS对于部分亲缘关系相近的菌种没有足够的区分度。常见的易混淆结果是复合群内的不同种，如阴沟肠杆菌复合群，包括阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌、霍氏肠杆菌、神户肠杆菌等，也有可能是属内多个近缘菌种，如李斯特菌属里的单核细胞增生李斯特菌、无害李斯特菌、斯氏李斯特菌、威氏李斯特菌等，甚至可能是不同属的菌株混淆，如大肠埃希菌与志贺菌属。建议关注制造商的易混提示/低分辨提示，再根据临床是否需要鉴定到种水平采取相应措施。
种特征不明显：谱图缺失种特异峰，分辨水平低，谱图与数据库中多个菌种匹配。通常体现为谱图质量不高，峰相对少，打分较低。建议采用提取法或者更充分的破壁方法进行前处理。
数据库缺少待测菌种：此时谱图可能会与数据库中存在的近缘菌种匹配，得出多个结果。通常发生在少见罕见菌种鉴定，谱图质量好，但分数不高。若多个结果属于同一个属，建议质谱报告为属水平结果，并通过基因测序等其他方法进行种水平鉴定。
混合菌和交叉污染：通常体现为不同菌种结果亲缘关系并不相近，且分数不高、峰较多。建议通过规范取样、制样来避免交叉污染；若是怀疑混合菌，进行重新分纯。
问题9 病原微生物采用不同方法鉴定，结果不一致时应如何处理？
推荐意见9 不同微生物鉴定方法学的适用性、病原谱、准确率有区别，当MALDI-TOF MS鉴定结果与其他方法不一致，推荐使用基因测序作为鉴定“金标准”。
病原微生物鉴定常见方法包括形态学、生化、MALDI-TOF MS和基因测序鉴定，对于一些肠道病原菌还需补充血清凝集试验。目前实验室采用全自动微生物生化鉴定仪和MALDI-TOF MS较为广泛，而基因测序可作为难鉴定菌的备选方案 ［ 44 , 45 ］ 。基因测序方法中，Sanger测序能够实现大部分常见微生物的种水平鉴定，但某些菌种（如诺卡菌、非结核分枝杆菌等），其特征核酸序列片段（如16S rRNA）分辨力有限，无法准确鉴定，常需要联合多个特殊性片段测序，甚至需要全基因组测序 ［ 46 ］ 。在日常的微生物鉴定时，应明确所采用方法的局限性及所要达到的鉴定水平（属/复合群/种），选用适宜的鉴定技术，必要时采用多种方法确认。
当不同方法鉴定结果不一致时，需要考虑如下因素：特定病原微生物采用不同方法学鉴定时的可信度：（1）肺炎链球菌和缓症链球菌群，质谱鉴定可能出现错误，而生化鉴定技术可作为补充 ［ 6 ］ ；（2）鲍曼不动杆菌复合群内菌种，生化鉴定方法尚无法有效鉴别，MALDI-TOF MS可明确区分复合群，基因测序可准确鉴定；（3）肠道致病菌，需补充血清凝集试验实现不同血清型的鉴别。
所选择方法的病原菌谱：不同鉴定方法所能覆盖的病原菌谱存在差异，基因测序>MALDI-TOF MS>生化鉴定。若鉴定结果不一致，应考虑待测菌是否在所选方法的病原菌谱内。如按蚊伊丽莎白金菌可被质谱正确鉴定，但生化鉴定卡的病原菌谱并不包括此菌种，可能被误鉴定为脑膜炎脓毒伊丽莎白金菌。
所选择方法的鉴定准确率：目前MALDI-TOF MS鉴定准确率已经接近分子方法，高于生化鉴定。不同方法结果不一致时，基因测序仍被认为是菌种鉴定的“金标准” ［ 47 ］ 。
问题10 不常见病原微生物的鉴定结果如何验证？
推荐意见10 Sanger测序可用于验证不常见病原微生物的质谱鉴定结果，推荐16S 核糖体RNA（16S ribosomal RNA，rRNA）（细菌）/内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）（真菌）作为靶基因，当无法鉴定到种水平，需要加测其他保守基因。
对不常见病原微生物的鉴定结果，建议查询其基本信息，并采用其他方法学的复核和验证，优先选择基因测序。病原学分子鉴定技术可采取保守区核酸扩增和Sanger测序结合的方式，细菌靶基因首选16S rRNA基因，通过与数据库中已知序列比对，相似度超过98.7%为同一种 ［ 48 ］ ，无已知序列超过阈值则可能是新种；真菌首选ITS基因，通常使用相似度97.0%作为同种阈值 ［ 49 ］ 。当首选靶基因分辨率不足（不止一个种超过阈值）时，需加测其他保守基因，具体可参照临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）MM18 ［ 50 ］ 。
基于测序技术的快速发展和成本的有效控制，亦可采用基因组测序技术实现不常见病原微生物的准确鉴定，基于基因组序列的平均核苷酸一致性分析，与模式菌株或参考菌株比对分值超过94.0%可认定为待鉴定菌种与模式菌株菌种一致 ［ 51 ］ 。
问题11 哪些病原微生物鉴定到种水平有重要临床意义？
推荐意见11 临床鉴定病原微生物需要尽可能鉴定到种水平。当质谱分辨率不足时，对于影响公共健康或影响临床决策的病原微生物，推荐采用其他鉴定方法报告到种水平。
原则上临床鉴定病原微生物应尽可能鉴定到种水平。MALDI-TOF MS无法鉴定到种时，需根据临床意义判断是否可报告至复合群或属水平。如有必要到种水平，可采用改进前处理提高质谱鉴定分数、或辅以其他方法进一步鉴定。以下几种情况需报告到种水平甚至是亚种水平。
影响公共健康、与严重疾病相关的病原微生物：细菌，如炭疽芽孢杆菌、鼠疫耶尔森菌、霍乱弧菌、白喉棒杆菌、单核细胞增生李斯特菌；真菌，如新型隐球菌与格特隐球菌、耳念珠菌等需要报告到种 ［ 52 ］ 。
菌种间致病性存在差异的病原微生物：例如（1）肺炎链球菌是临床常见的致病菌，而口腔/缓症链球菌常被认为是定植菌 ［ 53 ］ 。（2）血培养常见污染菌如凝固酶阴性葡萄球菌、棒杆菌属、丙酸杆菌等，若≥2套被检出，应鉴定到种以判断其临床意义。（3）血液或无菌体液中的牛链球菌群常与肠道肿瘤密切相关，应鉴定至亚种水平 ［ 54 ］ 。（4）尿标本分离到的解脲棒杆菌常与肾结石相关 ［ 55 ］ ，而在乳腺组织、脓液分离出的克罗彭施泰特棒杆菌则与肉芽肿性乳腺炎相关 ［ 56 ］ ，需鉴定到种水平。（5）嗜水气单胞菌复合群常无需鉴定到种，但如该类细菌引起食源性腹泻需进行病原学溯源或引起肠外血流感染、尿路感染及组织脓肿时，应准确鉴定到种水平 ［ 57 ］ 。
与经验使用抗菌药物相关的病原微生物：例如鲍曼不动杆菌尽管与皮特不动杆菌或医院不动杆菌同属于一个复合群，但鲍曼不动杆菌感染患者往往表现出更高的耐药率和病死率 ［ 58 , 59 , 60 ］ ，需要进行区分。真菌中容易产生耐药尤其是多药耐药的菌种，例如耳念珠菌 ［ 61 ］ 、印度毛癣菌 ［ 62 ］ 、尖端赛多孢 ［ 63 ］ 、多育节荚孢霉 ［ 64 , 65 ］ 、东南亚念珠菌 ［ 66 ］ 等需鉴定到种。部分非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）的质谱鉴定即使选用推荐的前处理方法仍会混淆，如设计分枝杆菌与塞内加尔分枝杆菌容易鉴定成偶发分枝杆菌，因NTM的不同菌种与临床治疗密切相关，应尽可能鉴定到种 ［ 67 , 68 ］ 。脓肿分枝杆菌复合群中的脓肿分枝杆菌脓肿亚种、脓肿分枝杆菌马赛亚种和脓肿分枝杆菌博莱亚种3个亚种抗菌药物治疗的效果存在显著差异，应尽可能区分到亚种水平 ［ 69 ］ 。
问题12 什么情况下临床可以报告到微生物复合群水平？
推荐意见12 在不影响临床决策的前提下，当MALDI-TOF MS对复合群内种的区分能力有限或是鉴定到复合群内不常见的种时，推荐将微生物鉴定结果报告到复合群水平。
对复合群内种的区分能力有限：有一种情况是MALDI-TOF MS鉴定结果即为复合群，如丁香假单胞菌复合群、黑曲霉复合群等。更常见的情况是涉及MALDI-TOF MS易混淆的一些近缘菌种，尽管结果显示鉴定到种，但由于区分能力有限，可能导至重复鉴定出现复合群中不同种的鉴定结果（参见问题8）。此时应结合临床意义，考虑报告到复合群水平，例如洋葱伯克霍尔德菌、新洋葱伯克霍尔德菌、多噬伯克霍尔德菌可报告洋葱伯克霍尔德复合群；弗劳地柠檬酸杆菌、布氏柠檬酸杆菌、杨氏柠檬酸杆菌可报告弗劳地柠檬酸杆菌复合群；趾间毛癣菌、须癣毛癣菌可报告须癣毛癣菌复合群。镰刀菌无论Sanger测序还是MALDI-TOF MS鉴定均难以准确鉴定至种，可根据MALDI-TOF MS鉴定结果报告至镰刀菌复合群水平 ［ 70 ］ ，如茄病镰刀菌复合群、尖孢镰刀菌复合群、藤仓镰刀菌复合群、肉色镰刀菌-木贼镰刀菌复合群、厚孢镰刀菌复合群、双孢镰刀菌复合群。
鉴定到复合群内不常见的种：当MALDI-TOF MS鉴定出复合群内较为少见的种，在经过基因测序复核后，为了协助临床决策，可考虑报告复合群水平，或是同时报告种和复合群。例如质谱鉴定出霍氏肠杆菌，可报告阴沟肠杆菌复合群 ［ 6 ］ ；质谱鉴定为银白色葡萄球菌，可报告为金黄色葡萄球菌复合群 ［ 71 ］ 。由于真菌分类学和命名的快速变化，根据最新的推荐 ［ 72 ］ ，临床少见真菌鉴定的报告应尽可能包含种名和复合群名，例如双希木龙念珠菌同时报告种名和希木龙复合群；波氏赛多孢报告种名和尖端赛多孢复合群。
问题13 MALDI-TOF MS对临床常见真菌的鉴定可以达到什么水平？
推荐意见13 MALDI-TOF MS可以作为临床常见真菌如念珠菌、隐球菌、曲霉菌的首选鉴定方法之一，对于鉴定不理想的部分丝状真菌，推荐结合其来源、感染部位、菌落形态、显微镜下形态等特征加以判断。
随着MALDI-TOF MS技术的发展、算法的优化以及数据库的版本更新，常见临床真菌的鉴定取得了显著的进展，特别是在某些属内（如念珠菌属、隐球菌属、镰刀菌属、曲霉属等）的近缘菌种之间，区分能力越来越强，可作为鉴别的首选方法。此外，实验室自建库可以有效提高真菌鉴定的准确率，目前MALDI-TOF MS结合自建库鉴定临床常见真菌的进展见 表1 。
MALDI-TOF MS鉴定丝状真菌仍然存在一定的挑战，经常无法得到种置信的结果，可能的原因如下。
蛋白质提取困难：丝状真菌由于细胞壁成分复杂，存在较多几丁质，使得破壁困难，容易出现谱图不佳的情况，例如峰少、分辨率差等，尤其是外瓶霉、枝孢瓶霉等暗色真菌，常出现鉴定分数低，难以鉴定到种水平 ［ 73 ］ 。
谱图一致性差：丝状真菌在不同生长时期，菌丝和产孢阶段，蛋白质指纹图谱可能产生一定的差异 ［ 43 ， 88 ］ 。且用不同的前处理方法，对谱图的影响也较大 ［ 89 ］ 。
复合群内难区分：临床丝状真菌存在许多亲缘关系相近的菌复合群/组，例如藤仓镰刀菌复合群中的层生镰刀菌和轮枝镰刀菌、须癣毛癣菌复合群中的趾间毛癣菌和须癣毛癣菌、杂色曲霉亚属中的杂色曲霉和聚多曲霉等 ［ 90 , 91 ］ 。与细菌、酵母及酵母样真菌相比，丝状真菌峰数量更少，特征信息更少，因此区分这些近缘菌种更加困难。
针对以上丝状真菌质谱鉴定的特点及难点，部分制造商创建了专门的真菌/丝状真菌数据库，设置有别于细菌的鉴定参数和算法，并在数据库中兼容同种丝状真菌不同前处理、生命周期不同阶段鉴定的谱图，提高了丝状真菌的鉴定水平。
尽管质谱鉴定临床真菌的可靠性在持续提升，但不同制造商的数据库存在差异，尤其是菌种覆盖度和鉴定性能差异较大，因此要求微生物专业人员结合真菌的来源、感染部位、形态学等特征对结果的准确性进行评判，以保证结果可靠性。
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