文章背景 循环中有肿瘤分离细胞(CTCs)的原发肿瘤、癌症或远处的肿瘤细胞，并进入患者的血流或淋巴系统。在外渗并在暴露于循环系统的压力下存活后，它们能够到达远处的器官。液体活检是一种微创采样方法，可用于癌症检测、预后、阐明复杂的化疗耐药机制和患者治疗管理，可以采取多种形式，包括但不限于尿液、脑脊液(CSF)和外周血样本。过去20年间，外周血样本在CTC富集/分离、检测和分选方面取得的技术进步引起了肿瘤科学界和肿瘤内科界越来越多的关注。虽然大量临床试验已经证明了CTC与预后的相关性，但其在诊断和治疗中的效用仍有待阐明。
文章内容 CTC是肿瘤诊断、预后和预测复发的生物标志物的有趣来源，但尽管在肿瘤生物学研究中对其进行了广泛研究，但其诊断效用尚未得到证实和验证。它们在人体生物体液中的稀缺阻碍了识别可能促进转移性播散的危险CTC亚群。在这一观点中，作者讨论了可能用于鉴定这些转移细胞的有前景的技术。首先描述了分离患者来源的CTC的方法，然后在扩增和分析中使用3D仿生基质，然后描述了在单细胞和单分子水平进一步分析CTC的方法。最后，讨论了未来如何结合使用原子力显微镜等技术来阐明机械和形态性质，以及使用基于纳米孔的检测来识别分子生物标志物，从而为患者和他们的医疗保健提供者提供更准确的诊断。 目前CTC富集和分选的方法，及有前景的分析技术 液体活检采集后，CTC富集主要依赖于生物物理学(无标记)或生物学(依赖标记)特性。依赖标记的技术通常涉及基于正或负亲和力的捕获，可以在试管(RosetteSep)或微流控通道(CellSearch或CTCChip)中进行。目前一些无标记技术是基于微过滤(ISET)和微流控设备(Labyrinth chip, Parsortix)的尺寸和变形性，或基于密度的梯度离心(Ficoll-Paque)或双向电泳(DEPArray)。一旦恢复，ctc可以使用仿生3D基质、原子力显微镜(AFM)和纳米孔技术进行扩增和分析。
含CTCs的三维细胞培养支架的制备策略及其相关应用 非细胞毒性水凝胶的日益增加在3D细胞培养新材料的开发和使用中发挥了核心作用。能够定制水凝胶成分、几何形状和大孔隙度的材料制造策略的兴起，为特定细胞类型构建相关环境开辟了令人兴奋的新途径。将CTC整合到这些材料中提供了解决药物筛选、CTC扩展或细化肿瘤发生模型等应用的可能性。虚线内是3D(生物)打印和冰模板，这两种技术有望在未来ctc的3D细胞培养支架的开发中发挥核心作用。
用于三维癌细胞培养的湿法和基于支架的方法例子 （a）BrCa患者ctc形成的球体荧光图像，CD44(干细胞标志物，上图)和波形蛋白(间质标志物，下图)均为阳性。比例尺100 μm。(b)来自PDAC患者的ctc衍生类器官的共聚焦图像;泛ck，绿色/DAPI，蓝色。刻度杆为10 μm。(c)第14天，在盐浸PCL支架(黄色箭头)中培养的mBRCA患者样本的红细胞(RBC)去除有核细胞扫描电子显微镜(SEM)图像。细胞间的接触由红色箭头表示。比例尺100 μm。(d)培养第3天，ha修饰PLGA NFs的相位衬度图像与加标HeLa细胞的荧光图像叠加在NFs上。
AFM原理及不同样品性质的提取 a, c. AFM原理:一端有尖端(a)或细胞(c)的悬臂与样品相互作用。悬臂的偏转由激光束监测，激光束从悬臂反射并指向光电二极管。尖端与样品的相互作用导至悬臂梁偏转和随后的激光束偏转，这被光电二极管记录下来，提供电信号作为输出。压电元件精确地控制悬臂梁相对于样品的运动。b, d.分析尖端-细胞(b)和细胞-细胞(d)相互作用的合力曲线，以提取样品的多种属性。逼近力曲线提供了样品形态(b)和力学性能(b, d)的信息。根据力曲线计算得到的高分辨率的形貌和弹性模量图(15 × 15 μm2)显示了(b)。撤回力曲线包含了悬臂与样品之间的相互作用(b, d)和膜系形成(d)的信息。直接计算系绳的数量，分离长度，和破裂力是可能的，从力曲线。
微流控捕获的局部和转移癌患者完整前列腺CTCs的AFM分析 a.显微图显示AFM尖端位于epcam染色的CTC中心上方，这样力的测量可以用于后续的纳米力学表征。比例尺30 μm。b. AFM尖端与CTC相互作用的代表性力曲线，其中黑色箭头表示尖端靠近细胞表面和从细胞表面回缩的方向。在初始尖端-胞体表面接触后，由于施加的恒定载荷，胞体会经历一定量的表面变形D。当尖端从细胞表面缩回时，由于与AFM尖端表面的相互作用，细胞会经历许多粘附力F(缩回过程中的峰值为1 - 7)，直到尖端完全脱离。在这个过程中，脱离的工作“WD”(零力线以下的灰色阴影区域)表示完全脱离细胞表面所需的工作量。c, d.测量局限性(n = 3)和转移性(n = 2)肿瘤来源的ctc的所有杨氏模量E、变形量d、粘附力F和脱离WD的功的分布直方图。实黑线是拟合对数正态或高斯概率密度函数的数据。
纳米孔用于ctc表征的应用 从原发肿瘤中分离的ctc可以恢复并在单细胞水平进行分析。提取的CTC生物标志物包括(1)蛋白质/肽，(2)微rnas和(3)DNA，然后可以使用纳米孔技术分析。在纳米孔实验中，一个含有纳米大小孔的绝缘膜被放置在两个充满电解质的隔间之间。当电压跨膜施加时，离子电流通过纳米孔(蓝色的孔)。通过孔的运输或相互作用引起电流的减少，由于离子运输的部分阻断(红色孔)。阻断电流的深度和持续时间取决于分子的化学性质、构象、大小和序列，但也取决于孔的几何形状。单生物分子纳米孔分析的应用包括潜在生物标志物检测、定量、测序和酶促反应测定。CTC检测已经通过纳米孔，使用针对特定蛋白膜生物标志物(MUC-1)的适配子实现。
CTC面临的挑战和前景 液体活检目前已被广泛接受为癌症诊断、预后和治疗的重要生物标志物来源。虽然越来越多的证据支持ctc的预后价值，但仍有大量工作要做，以验证其临床效用。新方法的出现和新装置的开发有助于CTC的分离、检测和分选，但它们都有各自的优势和局限性。如前所述，阳性富集不包括EpCAM阴性的CTC亚群，而阴性富集需要额外步骤来清除污染的残留血细胞。此外，正性选择方法以鉴定的膜蛋白作为标记来靶向特定的CTC亚群;因此，它们不能用作新细胞亚群的启发式策略。另一方面，过滤方法的纯度通常较低。此外，一些过滤和微流控装置施加高压，抑制CTCs的非破坏性释放。理想的“一应俱全”设备将允许以高性能指标同时分离、检测和分选活细胞。 转移是大多数(约90%)癌症死亡的原因，在异质性的CTC人群中识别具有转移特性的细胞是我们需要应对的一个主要挑战，不仅是对患者的治疗，而且是进一步验证ctc在临床环境中的使用。要有针对性地应对这一挑战，需要开发新型技术工具、创建集成平台、实现流程标准化，并且在我们看来，还需要广泛领域的专家(从STEM学科的基础研究人员到临床医师)之间开展更广泛的跨学科合作。 杭州乐为生医公司推出寡核苷酸纯化试剂盒 本试剂盒使用特殊的吸附膜和Bingding buffer，能够高效的将寡核苷酸片段结合到吸附柱上，适用于≥15nt-2kb片段的DNA的纯化回收，将寡核苷酸洗涤并浓缩到少量水(≥10 μl)中。纯化的寡核苷酸步骤简单，纯化后的寡核苷酸适用于抗体偶联、杂交，凝胶移位分析，酶促反应，连接，测序，微阵列分析等。吸附柱的结合DNA的量可达到10ug单链DNA或5ug双链DNA，回收率在85%以上。 订购热线：19957893538，微信同号
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