下一代分子诊断技术（上）

不同于PCR、Q-PCR、恒温扩增等传统已经广泛应用于市场的技术，这几年快速发展的CRISPR被评价为下一代分子诊断技术。

所谓分子诊断，就是围绕基因搞事情，传统的分子技术是把目标基因找出来，提取出来，检测出来。

能被称为下一代分子技术，必然有它更牛逼的地方，我们一一道来。

①CRISPR的由来

CRISPR是个缩写，全称是clustered regularly interspaced short palindromic repeats，一长串六个英文单词的简写，翻译叫成簇的规律间隔的短回文重复序列，简称一个巴拉巴拉序列。

起这么长的名字主要是因为科学家在发现它们的时候也不知道这是什么玩意儿，有啥功能，只是检测出来说这是一团成簇的东西，而且是间隔开的，又是很短的重复序列，就起了这么个名字。

就好比以前农村里生了个娃，大家都懒得起名字，看这娃长得黑，长得像刚出生的狗子，就取名黑狗。

这个巴拉巴拉序列最早在八十年代就被人在研究细菌时发现了，2001年有两个无聊的科学家给这货正式取了名字CRISPR，理由是各种描述序列的名字实在太多太复杂了，还是用简写吧。

后来的进一步研究发现，这些序列存在于大部分的细菌当中，当细菌受到噬菌体或者病毒入侵时，细菌会把入侵者的DNA片段切下来，当成战利品保存在CRISPR中，等下次再被入侵时，细菌就可以靠这段序列直接快速识别敌人，迅速干掉入侵者，属于细菌对外防御的机制之一。

那么细菌怎么干掉入侵者呢？这就要提到CRISPR的兄弟Cas，它俩是形影不离的好基友。Cas是一种蛋白复合物，名字就很好记了，叫CRISPR-associated protein。

Cas弟弟跟着哥哥混，目前科学家已经找到一群弟弟了，从Cas1到Cas14都有，这么多弟弟被分成两个团队六大类，第一团队以群殴为主，要几个弟弟组合起来才能发挥作用，第二团队以单挑为主，一个Cas弟弟就能起作用，后续应该会有更多的弟弟加入这个大家庭。

一般来说大家都更喜欢个体能力强的Cas弟弟，比如Cas9，Cas12，Cas13，Cas14等，表达Cas的基因和巴巴拉拉重复序列是紧密连在一起的，如下图：

所以大概的过程是这样的，一旦由病毒入侵，兄弟俩就会一起把敌人裂解了，把部分敌人的基因组整合到间隔序列中，等下次再有病毒进来，这些序列会先转录成CRISPR RNA（crRNA）和反式激活RNA（trans-activating crRNA，即tracrRNA），两者通过碱基配对形成一个向导RNA（single-guide RNA，sgRNA）,然后sgRNA和Cas组成复合物一起去干活。

Cas虽然是弟弟，但是特别暴力，如果说CRISPR是大哥，Cas就是那个打手。CRISPR负责把Cas送到指定的地方，一声令下，Cas就会冲上去三拳两脚就把目标基因咔嚓了。

这个组合就十分科学了，一个负责找对人（CRISPR），一个负责砍(Cas)，配合起来效率奇高。

②CRISPR的发展

大家都知道，自从基因被发现以来，科学家就在寻找能够编辑基因的办法，但是大部分的方法都效率低下且没办法大规模实施，随着CRISPR/Cas的出现，一下子就引起了人们的关注。

最重要的突破发生在2012年，两位女性科学家Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier通过将两个RNA 分子融合成一个向导RNA，当向导RNA(gRNA)与 Cas9 结合时，可以精准找到并切割编辑目标DNA。

通过人工编辑gRNA的基因序列，可以任意编辑所需的靶向DNA。这就厉害了，这种能在想要的地方任意切割DNA的能力彻底改变了生命科学，于是她俩获得了2020年的诺贝尔奖。

顺便提一下，这也是第一次将诺奖授予两名女性，没有男性合作者。

自从CRISPR/Cas9被发现之后，这把魔剪就开始在全球广泛研究和应用。不但在很多基础研究中有很多贡献，在医疗方面，更是引发了研究热潮。

很多人把这个技术用于治疗癌症、遗传病，但是如果没有监管，可能会引发伦理灾难。

为什么呢？因为人类的基因组是一套精巧且复杂的系统，同一个基因可能和多种功能有关，而且大部分基因的功能我们至今未知，因此对于一个基因进行编辑可能带来的改变，实在难以预料，可能改变整个人类。

而且魔剪可能被用于除了治疗疾病之外的其他用途，比如用于提升人体的某些能力，比如外表，智商，寿命等等，这是接近于传说中神的能力。

如果这种能力被顶级阶层垄断，各位想象一下。

之前小阁在《圣湘生物入股的真迈生物以及基因治疗时代》曾经提过，2018年全球第一个CRISPR临床试验在中国进行，也就是生命科学最大的丑闻之一“基因编辑婴儿”。贺建奎运用CRISPR/Cas9基因编辑敲除CCR5基因，使一对双胞胎女婴拥有HIV免疫力，创造出世界首例“基因编辑婴儿”。

后来贺建奎因“基因编辑婴儿”被判处有期徒刑三年。

扯远了，回到CRISPR/Cas9。

gRNA序列是和特定的目标基因dsDNA互补的单链核苷酸，由两个部分组成，间隔序列，由20个核苷酸组成，主要作用是靶向DNA，以及一个主干序列，主要作用是将其锚定在蛋白质上。

Cas9是一种内切酶，当gRNA和目标基因配对后，就会触发Cas9蛋白的切割功能，进而剪断目标基因的核苷酸键。

那么怎么保证Cas9在精确的位置进行切割呢？

这就是PAM序列（也叫相邻基序）的作用了。PAM一般由NGG三个碱基组成，当CRISPR定位到PAM序列时，就会与之结合，并在PAM序列上游3到4个核苷酸的位置进行精准剪切，不同的DNA存在不同的PAM序列。

切割发生后，细胞自身的DNA修复机制就会通过非同源末端连接的方法将被切断的核苷酸重新粘在一起，但是通常会出错或者修复不完善，导至该序列不能再被读取和翻译。

也就是说切掉了，即使再连回去，也没用了。

与之对应的是另外一种修复方式，叫同源介导修复，在切掉的同时，同时导入DNA模板并插入到精确的位置，引入的供体DNA作为新插入序列模板修复DNA，这也是进行基因编辑的基础操作。

简单来说，CRISPR/Cas9的本质就是把一个特定的蛋白质（剪刀）引导到一段特定的基因上，进行基因操作，如果说Cas9是导弹头，gRNA就是精确制导系统。

先写到这，未完待续。