下一代分子诊断技术（下）

接着之前的文章介绍一下CRISPR/Cas在分子诊断中的应用。

一开始CRISPR多被用于基因编辑领域，这里面也发生了很多故事。因为CRISPR/Cas9具有特异性基因序列定位能力，开始有人把它用于核酸检测。

查了一下，最早有报道的是在2016年，Pardee率先做出基于CRISPR/Cas9技术，他结合NASBA（核酸依赖性扩增），小阁以前的文章中有提到这个恒温扩增技术，做出肉眼可见结果的POCT寨卡病毒检测平台。

之后，随着Cas12和Cas13附属切割活性的发现，和Cas9相比降低了脱靶（未严格按照设计要求剪切）问题，CRISPR的核酸检测功能这几年开始飞速发展，进入一个新阶段。

这种附属切割活性指的是，当Cas12，Cas13激活切割靶序列的同时，还会以极高的效率切割周围的核酸片段，这相当于自带信号放大的特点，围绕这个特点可以设计出很多信号读取方式。

目前常见的几种应用，通常使用四种Cas系统：Cas9，Cas12，Cas13和Cas14。

①  国外CRISPR

诺奖得主的Doudna她们就利用了Cas12的附带切割效应开发了核酸诊断试剂。原理就是用荧光淬灭基团标记游离单链DNA，当Cas12切割目标基因的同时也会切割周围游离的单链DNA，DNA被切断，荧光基团降解，发出荧光信号。

她们结合RPA研发出检测HPV分型的产品，该产品称为DETECTR，并以此为基础成立了Mammoth猛犸公司，并把DERECTR作为诊断平台，还提供OEM服务。

CRISPR领域著名的张峰团队则在Cas13a系统中引入了恒温扩增RPA技术，也创建了一个技术平台叫SHERLOCK夏洛克，成立了家公司，也叫夏洛克。

它的主要原理包括靶基因扩增，体外转录成RNA，然后用Cas13a剪切，释放荧光信号。

这个平台DNA和RNA都能检测。如果是DNA，则通过RPA扩增，如果是RNA，则通过逆转录RT-RPA扩增，然后将扩增的DNA产物用T7转录成RNA分子。Cas13a在gRNA的引导下切割靶RNA，同时切割周围已经加入荧光基团的RNA，释放荧光信号。

之后他们还研发出SHERLOCK二代，引入了另一种辅助酶Csm6，两种酶协同效率更高信号更强，检测灵敏度提高了3.5倍。

夏洛克二号引入了试纸条，用胶体金和生物素标记探针，通过调整探针的浓度，保证探针没有被切割时，所有胶体金都能汇聚到质控线，一旦探针被切割，就会有胶体金越过质控线到达阳性结果线。

更进一步，他们还把三种Cas13蛋白和一种Cas12a整合在一个体系中，一个体系同时检测4种病原体，解决了不能进行核酸多重检测。

现有的CRISPR诊断产品选择的扩增方式多采用等温扩增，除采用RPA外，还常采用LAMP（Loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增）和RAA（Recombinase Aided Amplification，重组酶介导等温扩增）。

去年夏洛克开发的产品成为首个获得FDA认证的CRISPR检测试剂，选用S基因和Orf1ab基因作为靶点，整个核酸检测耗时1h，包括提取、LAMP(环介导等温扩增）扩增、Cas13反应和试纸条检测，检测限低于10 copies。

除此以外，还有CRISPR结合石墨烯场效应晶体技术，CRISPR结合纳米孔技术，CRISPR结合电化学传感器技术等等，五花八门的技术，有兴趣的自行了解一下。

②  国内CRISPR

国内的公司也陆续有产品获批，已批准的产品2个，审批中的产品1个。从现有资料看，这些试剂主要分为两种，最低检测限在450copies-1000copies之间。

一种是采用Cas12a或Cas13a，这两种剪切蛋白来自外购，目前还没有自行制备的能力，另二种是国内自研的CRISPR/Cas系统，比如中国科学院动物研究所周琪院士团队，其研究者采用的是CRISPR/Cas12b剪切系统，

首个获得NMPA批准的是杭州众测生物与军事科学院军事医学研究院联合研发的新型冠状病毒2019-nCov 核酸检测试剂盒（CRISPR免疫层析法），原理是CRISPR+RAA（重组酶介导恒温核酸扩增），检测N基因。

第二个获批的是上海伯杰的恒温CRISPR法新冠检测试剂，还配套了专门仪器BG-Nova-X8，采用CRISPR+RPA，原理之前提过，也是检测N基因。

除此以外，国内公司关于CRISPR检测试剂进展的消息不断，可以预见未来一两年国内也会井喷式出现各种CRISPR+恒温扩增的检测产品。

从目前的进展来看，综合国外的报道，基于现有的技术开发出CRISPR的检测平台大概只需要2周左右。

综上，基于CRISPR/Cas开发的核酸检测技术相比于传统的分子诊断技术，主要有以下几个方面的优点：

1.操作简单，不依赖复杂的设备和严格的实验室条件，结果读取简单。

2.成本低，目前国外报道DETECTR单测试成本低于1美元，比国外传统的PCR试剂成本还低。

3.检测速度快，一般在几十分钟到1小时内完成。

4.灵敏度高，经过不断的完善，现在的灵敏度可以达到fmol级别。

5.多重检测，设计不同的Cas针对不同的靶基因可以实现多重检测，CRISPR在多重检测中有巨大的潜力。

总结一句话，既有POCT的简单速度快，又有中心实验室的结果准，成本还低，想不火都难。

当然，也有局限性，比如脱靶效应，会造成检验结果的假阴性或者假阳性，这点随着研究的深入也在逐步解决。

总的来看，CRISPR/Cas这把魔剪不但给基因治疗领域带来革命性改变，也给基因检测领域带来突破性进展。