| 质谱技术自20世纪初诞生以来，已有100多年历史，期间有十多位研究者因在质谱的发明发展和研究应用上做出重要贡献而获得了诺贝尔奖。在其不断推陈出新的过程中，质谱技术的应用范围也逐渐拓宽，成为了重要的科学研究工具之一。而质谱技术对生物大分子的研究，则为其在生物医学领域中的应用埋下了伏笔，其中核酸质谱便是当前临床医学中极具应用潜力的工具之一。质谱技术(mass spectrometry)是分离和检测带电粒子质荷比的分析技术，相当于一台特殊天平，用于分类称量离子质量。以其高特异性、高灵敏度、高耐受性、分析快速与检测信息丰富的特点，越来越受到临床研究和诊断的关注。质谱技术早期在临床实验室的应用，主要是气相色谱质谱(Gas Chromatography MassSpectrometry, GC-MS)对军事药物使用的监测。但GC-MS主要适用于挥发性和热稳定性化合物，样品制备程序复杂，检测通量低，这限制了其在临床中的进一步应用。直至快原子轰击、电喷雾和辅助激光解析等“软电离”技术的发展，产生了诸如液相色谱-串联质谱 (liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)、电感耦合等离子体质谱技术(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)和基质辅助激光解吸飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)等新方法后，才使得质谱技术对蛋白质、酶、核酸等生物大分子的检测成为可能，也大大拓宽了其在医学检验领域的应用范围。其中，基质辅助激光解吸电离技术(matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI)据称是在一次误用化学试剂的操作中发展起来的，其发现者田中耕一也在2002年获得了诺贝尔化学奖（同步期待10月4日下午即将揭晓的2021年第一个诺贝尔奖项——诺贝尔生理学或医学奖，不知花落谁家）。该技术通过引入基质分子，使待测分子不产生碎片，解决了非挥发性和热不稳定性生物大分子解吸离子化的问题，实现了生物大分子的软离子化，便捷地将生物样本引入质谱系统，再结合飞行时间质量分析器(time-of-flight, TOF)，实现了生物大分子（核酸、蛋白质和有机物等）的快速分析，产生了目前临床应用最为广泛的微生物鉴定、核酸分析等方法。MassARRAY®是美国Agena Bioscience（原Sequenom Bioscience）公司基于MALDI-TOF原理建立的核酸质谱分析系统，其基本原理是将预处理后的PCR扩增产物，通过仪器点样至带有基质的芯片上，使其与基质结合形成共结晶；再用激光照射复合物晶体，经辐射的基质分子吸收并积蓄能量后迅速升温，使得晶体升华进入气相状态，核酸分子也随之解吸并转变为亚稳态离子（多为单电荷离子）；这些单正电荷离子可在加速电场中获得动能，并在飞过自由漂移区后向检测器飞行，且离子质量越小，飞行速度越快，也就更早到达检测器，不同分子量的核酸分子因到达检测器的时间不同而得到检测。该系统整合了PCR技术的高灵敏度、芯片技术的高通量、质谱技术的高精确度，以及生物信息的智能化分析功能，为临床研究与应用提供了另一个技术平台。核酸质谱是一把高精度的天平，可区分单个碱基的质量差异(G>A>T>C)，而核酸质量又与碱基组成与长度有关，因此在PCR预处理过程中，使用不同方法形成碱基质量有差异的质谱待测物，则可实现核酸分子的不同检测目的。如通过单碱基延伸和分子切割的两种生物化学技术，使得核酸质谱可用于SNP检测和甲基化分析。单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，其在遗传疾病的诊断和筛查以及用药种类及剂量指导等方面有着极其重要的作用。MassARRAY®可通过精确区分4种碱基的分子量差异，对SNP进行检测。其在PCR过程中采用了两轮扩增，从而生成了可用于质谱分析的单碱基延伸产物，详细技术原理如下：①在跨越SNP位点的上下游区域设计一对引物，该对引物的5’端带有10 mer tag(ACGTTGGATG)，其目的是使第一轮PCR引物≥30bp（质谱图峰检测的范围是4500~9000 Da之间，而碱基平均分子量为300 Da，因此对应的核苷酸检测范围为13~30bp，这样第一轮PCR引物即使未能被后面的SAP完全消化，也不会出现在质谱图中）。该过程也可针对不同SNP位点设计成多重PCR，目前单个反应可达10~60重检测。由此扩增出含有SNP位点的第一轮PCR产物，加入虾碱性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase, SAP)去除剩余的dNTP后，为第二轮PCR做准备。②针对每个靶点，在紧挨其SNP位点处设计一条单碱基延伸引物，并在体系中加入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，以第一轮PCR产物作为模板进行延伸，使得延伸引物在SNP位点处延伸一个碱基后即终止，由此每个SNP的等位基因延伸产物仅有末端一个碱基的差异。③将第二轮PCR产物与树脂混合，通过离子交换去除液体中吸附于DNA片段上的离子，再在系统上进行质谱分析获得图谱，根据延伸产物分子量的不同，于对应各自的分子量位置查看检测峰图。在人类基因组中，DNA甲基化一般发生在CpG位点（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点），其胞嘧啶会在DNA甲基化转移酶的作用下与甲基基团结合转化为5-甲基胞嘧啶，作为一种重要的表观遗传学标记，在调控基因表达、维持染色质结构以及胚胎发育等生物学过程中发挥着重大作用。MassARRAY®可通过对前期酶处理后的产物分析，根据碱基G和碱基A之间16 Da的分子量差异区分出甲基化和未甲基化的C，并利用各自的峰面积计算出该CpG位点甲基化比例，从而估算整个检测片段内的平均甲基化水平，详细技术原理如下：①通过亚硫酸氢盐反应将序列中未甲基化的C转化为U，而甲基化的C保持不变，由此甲基化和未甲基化的碱基分子量便开始显现出差异。②使用5’末端带有T7启动子序列的下游引物对目标CpG岛区域进行PCR扩增，形成带有T7启动子的扩增产物，并在扩增后加入虾碱性磷酸酶处理残余dNTP。③利用T7转录酶对扩增产物进行体外转录，形成与反向序列一致的RNA转录产物，即未甲基化的C最终变为A，而甲基化的C最终变为G。④在转录产物中加入特异性核糖核酸内切酶，如利用RNase A特异性识别并切割RNA中U碱基3’端的特性，将产物切割成各种带有CpG位点的小片段RNA，形成不同分子量的检测产物。最后不同片段大小的核酸在质谱图上的不同位置显示，而甲基化不同也会形成分子量有差异的峰图。Agena Bioscience MassARRAY系统的检测流程采用了自动化高通量操作设计，PCR及延伸反应完成后，可将PCR反应板及SpectroCHIP芯片载入MassARRAY CPM全自动系统，进行样品检测并实现远程数据分析。其检测流程整合了高灵敏度多重PCR→高通量芯片上机→高精确度质谱分析→自动化报告生成，最大限度的降低质谱操作要求，减少手工操作带来的潜在污染及样本操作误差。核酸质谱从检测程序上看，是分析PCR扩增后产物大小的一种检测方法，具有分辨率高、分离速度快、杂质干扰少的优点。作为一种中通量、多靶标的检测方法，核酸质谱在自动化操作上还比不上荧光PCR，但在数据分析上则远比高通量测序方法简单。与其他常规分子诊断试剂一样，其待测物同样需要经过样本处理、核酸扩增等步骤后，才能满足临床诊断要求。在样本前处理上，需通过核酸提取纯化，以便于PCR扩增。在多重PCR扩增设计时，也同样需要考虑不同引物之间的相互干扰，确保扩增产物的特异性。只是核酸质谱检测的是核酸片段的固有物理性能——质荷比，无需特殊修饰的引物或探针。另外，由于检测中引入了PCR扩增过程，且中间需对扩增产物进行纯化等操作，而目前质谱检测系统还未达到一体化水平，全流程自动化程度又较低，因此对操作人员和实验室资质均有一定要求。为防止气溶胶污染等风险，操作区域依然需要建立试剂准备、标本制备及核酸扩增等至少三个符合PCR实验室要求的独立分区。在结果展示上，谱图质量的优劣将直接影响最终检测结果的分析。而在检测过程中，检测结果易受到基质效应、结构类似物干扰以及质谱信号产生不稳定等带来的影响，对这些问题认识和预防不当，则质谱的检测结果将存在潜在错误风险。最后，当核酸质谱越来越多地应用于分子诊断，特别是在多病原体联合检测上，以其中通量的检测定位，其通量之下有荧光PCR或核酸分子杂交，其通量之上有高通量测序，那么，在临床注册申报以及市场应用时，是否会陷入进退两难的困境？
参考资料 [1] Agena Bioscience官网. [2]中国核酸质谱应用专家共识协作组. 中国核酸质谱应用专家共识[J]. 中华医学杂志, 2018(12). [3] Ellis J A , Ong B. The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping[J]. methods mol biol, 2017. [4] Kunze S. Quantitative Region-Specific DNA Methylation Analysis by the EpiTYPER™ Technology[M]. 2018. [5] 部分图片来自网络，若涉及侵权，请联系删除.
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