特邀·述评|循环肿瘤细胞的“旧语新说”

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【引用格式】:王砚春,杨晓蓉,郭林,等.循环肿瘤细胞的“旧语新说”[J].国际检验医学杂志,2021,42(7):769-773.

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王砚春1,2，杨晓蓉1，郭 林1,2，卢仁泉1,2△

1.复旦大学附属肿瘤医院检验科，上海 200032；2.复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032

       CTC是指从原发肿瘤中游离出来,进入血液或其他体液的肿瘤细胞[1]。虽然THIELE等[2]较早就提出了CTC的概念,但CTC在外周血中十分稀有,仅少量上皮间质转化细胞或侵袭性肿瘤细胞能够侵入血液,只占所有肿瘤细胞的0.000 000 1%[3]、外周血有核细胞的0.000 1%(1~10个细胞/mL)[2],所以通过常规检测方法几乎无法识别。

      随着检测技术的发展,经过分离、富集、标记、鉴定等步骤,捕获并检测体液中微量的CTC 已得以实现。此外,CTC未经富集的直接检测技术[4]、体内置入的实时富集技术[5],也已转化临床。

      2.1 CTC的分离富集    CTC的分离富集主要依据肿瘤细胞的物理性质和生物学特性进行,包括基于细胞大小、密度、电荷的细胞过滤法,密度梯度离心法,介电泳分离法,以及依赖细胞生物标志分子的阳选与阴选策略等。

       CellSearch检测系统是美国食品药品监督管理局(FDA)批准的首个CTC检测方法[6]。这项技术采用上皮细胞黏附分子抗体,捕获具有上皮间质转化特征CTC[7]。无独有偶,我国cFDA 也批准了Ⅲ类医疗器械CTC采样针CellCollector,其随着全身血液循环不断捕获细胞,提高了CTC 的检测灵敏度[5]。近年来,与微流控技术相结合的CTC 富集方法树立了CTC检测的新里程碑。微流控技术不仅可以保持CTC分离的效率和纯度,而且可以确保CTC的完整性和活性[8]。同时,新近兴起的其他CTC 分离方法也大大提高了检测效率、降低了检测成本;但是,每种分离富集方法都存在一定的局限性,见表1。

       2.2 CTC的标记与鉴定   分离富集后的CTC需要进一步进行染色标记与鉴定,经典的标记鉴定方法包括细胞免疫荧光技术、PCR 方法等;其中最常用的方法为细胞免疫荧光技术,通过荧光显微镜检测将角蛋白阳性,CD45阴性和4',6-二脒基-2-2苯基吲哚阳性的细胞定义为CTC[9]。

       美国FDA批准的CellSearch检测系统,就是以该形态学与表面标志为主要诊断依据,可用于监测转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌的预后[10]。这项技术如何结合核酸分子等特异性鉴定,全面获取肿瘤细胞的携带信息,避免干细胞假阳性污染,提高捕获效率与诊断性能,是CTC检测重返市场所需攻克的难关[10]。

       近年来,采用叶酸受体免疫磁珠负向筛选联合靶向荧光定量PCR方法(国械注准20163400061),从一定程度上弥补了上述CellSearch检测CTC 的缺陷,能够靶向并定量检测人全血中叶酸受体阳性的肿瘤细胞,可用于早期肺癌的辅助诊断及非小细胞肺癌患者的疗效监测[11]。

      CTC测序技术能够精准反映肿瘤体细胞变异和基因表达变化,全面检测分析CTC 成为可能[12]。CHENG等[13]开发的Hydro-Seq平台,可以对CTC进行单细胞转录组分析,从分子层面分析CTC 的基因表达图谱,不仅有助于CTC亚型分类、提供肿瘤异质性参数,而且通过雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体2(HER-2)等药物靶标的分析还为激素和靶向药物的使用提供依据,突显了CTC测序在精准医学中的潜在价值。

      在肿瘤诊断过程中,肿瘤异质性会带来检测对象的随机选择,肿瘤组织活检的细针抽吸对肿瘤肿块的部分取样,不能反映肿瘤组织的全貌。从原发肿瘤脱落的CTC,携带有肿瘤的全面信息,在肿瘤相对早期阶段即可从体液中分离出来,比发现原发肿块或转移灶的常规检测方法更为灵敏,因此在肿瘤的临床诊疗中发挥着重要作用。

      3.1 CTC与肿瘤早期辅助诊断    肿瘤的早期辅助诊断一般依赖于影像学与肿瘤标志物的检查,但对于最大径小于5 mm 的肿块,影像学难以发现[14];同时大部分肿瘤标志物的特异度不高,不能作为诊断的独立指标,目前肿瘤早期辅助诊断的方法仍具有一定的局限性。然而CTC 的检测灵敏度相对较高,对肿瘤的早期发现有着重要价值。

       ILIE等[15]发现,对慢性阻塞性肺疾病患者进行CTC检测并随访,检出CTC的患者在之后的随访期间均发现罹患肺癌,真正做到了肿瘤的早发现、早诊断。YIN 等[16]使用叶酸受体富集CTC,对肺癌诊断的灵敏度为87.1%,相比常用的筛查方法———低剂量计算机断层扫描更加便捷、省时。CTC与传统的血清肿瘤标志物相比,也展现出在早期诊断方面的巨大潜力。吴方等[14]发现CTC诊断肺癌的灵敏度、特异度分别为77.1%、89.6%,均高于传统血清肿瘤标志物(神经元特异性烯醇化酶、糖类抗原125、糖类抗原153、细胞角蛋白19的可溶性片段、鳞状上皮细胞癌抗原)。GUO 等[17]使用带有阴性选择的定量PCR平台,对具有干细胞表型的CTC进行检测,发现对早期肝癌患者的诊断特异度高达94.2%,诊断性能比血清甲胎蛋白更好。

      当然,由于CTC捕获效率的差强人意,CTC检测仍面临着巨大挑战。CTC分离鉴定方法的局限性,易造成CTC的丢失或者误判,从而出现假阴性或假阳性结果。在基于核酸检测的技术中,虽然具有较高的灵敏度,但仍需要解决CTC 损耗、纯度低、检测谱窄等问题[18]。近年来,不少新兴技术的出现为CTC检测具有更高的灵敏度和特异度提供了新方向,例如Ephesia CTC芯片将免疫磁珠技术与微流控技术相结合,可将CTC的捕获效率提高到90%~94%,检测特异度达到99.6%[19]。

       此外,使用CTC和循环肿瘤DNA(ctDNA)相结合的检测方法,可以进一步提高液体活检的敏感性[20]。在一项针对多发性骨髓瘤患者的研究中发现,ctDNA与富集的CTC之间没有直接相关性,CTC和ctDNA 具有不同的遗传突变谱[21]。因此,结合CTC和ctDNA 的检测方法可以在不降低特异度的情况下相互补充,更灵敏地检测肿瘤特异基因的改变,有助于肿瘤的精准检测。

      3.2 CTC与肿瘤疗效的关联    随着多种新辅助疗法的应用,以及肿瘤靶向治疗理念的革新,传统监测肿瘤疗效的方法已无法为临床提供及时准确的疗效信息[22],CTC检测在肿瘤疗效监测方面赋予了重要作用。首先,通过检测CTC的组分蛋白,有助于临床治疗方案的选择。例如,在乳腺癌患者中,CTC表面的HER2状态可以辅助指导靶向药物的使用,即使是原发肿瘤HER2阴性的患者,也可因为检测到HER2阳性的CTC,从而采取有效的靶向治疗并从中获益[23]。同样,FUJII等[24]在转移性乳腺癌患者中分析ER的表达,发现在原发肿瘤ER阳性的患者中,出现了ER阴性的CTC,能够解释ER 靶向治疗失败的原因,得出监测CTC的ER表达可以优化乳腺癌治疗的结论。

       CTC表面标志也有助于免疫疗法的评估;CTC检测可能成为一种可靠的方法,反映肿瘤整体的生物学特性,对免疫治疗策略的抉择至关重要[25]。例如在胃肠道肿瘤中,CTC 表面的PD-L1表达水平可作为筛查PD-1/PD-L1阻断疗法的预测指标,测量CTC的动态变化可监测免疫治疗的有效性[26]。此外,在晚期非小细胞肺癌患者自然杀伤细胞治疗后,CTC数量的减少与治疗疗效密切相关,CTC也是评估自然杀伤细胞疗法疗效的标志物[27]。

       其次,CTC计数和表面标志是监测疾病进展、治疗的有力工具,其内部的核酸组分也具有提供临床治疗信息的巨大潜力[28]。一些研究表明,仅CTC计数不足以指导治疗决策,但对CTC进行核酸分析,可以辅助靶向治疗方案的确定[29]。例如通过筛选CTC中的鼠类肉瘤病毒癌基因、表皮生长因子受体、HER-2、ER等基因突变,将CTC基因组与原发肿瘤基因组进行差异分析,能为靶向治疗动态监测提供新的见解[30]。对CTC进行RNA分析可用于耐药相关分子的鉴定。MIYAMOTO等[31]对前列腺癌患者外周血CTC 进行单细胞RNA分析,发现CTC与原发肿瘤之间存在表达谱差异,相关信号通路的异质性是导至雄激素治疗无效的原因。在局部晚期直肠癌的CTC中,通过原位杂交检测胸苷酸合酶mRNA发现,胸苷酸合酶 mRNA表达的患者不存在病理完全缓解的情况,对新辅助化疗不敏感,提示CTC的核酸分析可准确预测病理完全缓解情况,从而免除根治性手术的可能[32]。

       最后,CTC可作为探索肿瘤新生细胞和治疗策略研究的新手段[33]。从晚期肿瘤患者中分离出的CTC可制备异种移植物,进行功能表型和药理研究;制备离体培养物,进行药物筛选和全基因组、蛋白质组分析等[34]。ZHANG等[35]从间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性肺癌患者中获得CTC 进行离体培养,并用2种ALK 抑制剂:赛可瑞和色瑞替尼进行药物敏感性测试,发现色瑞替尼是一种更有效的ALK 抑制剂。这种通过分离CTC建立体外模型、进行个体化药物治疗的研究,为CTC在疗效监测方面的转化应用打开了新的思路。

      3.3 CTC与肿瘤患者预后    通常情况下,CTC数量随着肿瘤远处转移的进展而增加,大量研究发现CTC计数与无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)密切相关,可作为评估临床预后和复发风险的重要依据[36]。在早期前列腺癌、乳腺癌和结直肠癌中应用的CellSearch系统,每7.5 mL外周血中有≥5个CTC是PFS减少的有效预测指标[37]。

     此外,CTC表面特异性标志物的变化对判断肿瘤的预后情况有重要价值。SPARANO 等[38]在乳腺癌复发患者中发现,ER阳性CTC患者比ER阴性CTC患者的复发风险高13.1倍。WANG 等[39]发现在放疗后的转移性肺癌患者中,CTC PD-L1的表达增加与预后不良相关,PD-L1阳性CTC 可作为恶性肿瘤预后的标志物。

      在核酸水平上,一项Meta分析发现,在非转移性结直肠癌中,通过PCR方法检测的CTC阳性患者的OS和无病生存期(DFS)较CTC阴性患者显著缩短;并且CTC与许多预后不良指标相关,如淋巴结转移、血管侵犯、肿瘤分化程度低、TNM 晚期等[40]。通过数字PCR方法检测胰腺癌患者CTC的基因表达,发现未经治疗的胰腺癌患者其CTC中具有较高的ALCAM、POU5F1B和SMO mRNA 表达,这些患者的PFS和OS显著缩短[41]。HINZ等[42]使用CK20实时荧光定量PCR方法检测CTC,发现其是结肠癌的独立预后标志物,CTC阳性患者的复发风险明显升高。

       早在2010年美国癌症联合委员会制订的《肿瘤分期指南》中,已把CTC 列入TNM 分期系统[43]。cM0(i+)微转移的分期概念出现在传统检测方法认定肿瘤尚未达到M1水平,但循环体液中却能检出CTC的肿瘤转移早期阶段。虽然这种分期在临床实践中很少使用,CTC能否作为可靠的分期标准还有待商榷,但是CTC作为肿瘤分期的重要工具,已受到广泛重视。例如在胃癌中,CTC≥4的患者比例随着肿瘤分期的增加而增加,Ⅳ 期时可高达95.24%[44]。CRISTOFANILLI等[45]分析了2 436例复发转移性乳腺癌患者,将每7.5 mL 5个CTC设为阈值进行分层,CTC≥5被列为Ⅳaggressive 期 ,CTC<5为Ⅳindolent期,并且使用Kaplan-Meier曲线和Log-rank检验分析发现前者的OS显著缩短(16.0个月vs.36.3个月,P <0.001),从而证明CTC是转移性乳腺癌Ⅳ期分层的理想标志物。

       CTC检测作为液体活检技术的重要成员,在肿瘤诊疗方面发挥重要作用。CTC携带了原发肿瘤的异质性信息,可作为一种有效的生物标志物和模型工具。通过非侵入性活检、分离并鉴定的CTC,在肿瘤早期诊断、实时疗效监测和预后评估等方面得到广泛应用。但是,目前CTC检测在检测技术的优化、临床应用的完善上仍然有着较大的提升空间。一方面CTC的检测技术仍在不断更新,新兴发展的检测技术需要充分验证,获得批准才能进入临床;另一方面,肿瘤异质性一直是肿瘤诊疗的一大难题,CTC异质性能否反映肿瘤全貌,在临床应用上仍然面临着挑战。

      随着科技不断进步,在单细胞水平上对CTC 进行基因组、转录组、蛋白质组分析,以及CTC 体外模型的不断完善[46],可促进肿瘤研究的不断深入,为肿瘤诊断、预后、治疗、病因机制和药物开发等领域开拓新的视野。相信在不久的将来,随着技术的持续改进、标准化方案的制订、待解决难题的不断攻克,CTC检测将会为肿瘤临床诊疗带来更多便利。

      参考文献略

编辑：张梨虹        审校：张耀元