1、冻存液的配制
① 取一个洁净的100 mL培养瓶,依次加入35 mL甘油(纯度≥99%)和15 mL新鲜培养基,配制成70%甘油+30%培养基的混合液。
② 将培养瓶封口后,置于高压蒸汽灭菌锅中,121 ℃灭菌20 min,彻底杀灭杂菌。
③ 灭菌结束后,待冻存液冷却至室温,转移至4 ℃冰箱保存备用,可有效减少高温对甘油和培养基成分的破坏。
2、菌株培养
① 根据目标菌株选择最适培养基:例如大肠杆菌常用LB培养基,链霉菌常用TSB培养基。
② 将菌株接种至相应培养基中,置于适宜温度(如37 ℃或28 ℃)和转速(150–200 rpm)下振荡培养。
③ 监测菌液OD600值,待其达到对数生长期(一般细菌OD600 0.6–0.8)时即可用于保菌,此时菌体活力最高,保藏成功率最佳。
3、菌液分装与混合
① 在1.5 mL无菌EP管侧壁或管盖上清晰标记:菌种名称、保藏日期及操作者信息,方便后续追溯。
② 使用移液器依次向EP管中加入0.5 mL冻存液和0.5 mL菌液(1:1体积比),最终甘油浓度约为35%。
③ 充分混匀:
• 方法一:用1 mL移液枪轻柔吹打10–15次,避免产生大量气泡;
• 方法二:将EP管置于涡旋混匀仪上,调整适当倾斜角度,使液体形成均匀漩涡,直至呈现均一乳浊状。
④ 混匀不充分会导至菌体分布不均、冻存损伤加剧,显著降低复苏存活率,务必保证混合彻底。
4、菌液冻存
① 将混匀后的冻存管直接放入–80 ℃超低温冰箱或液氮罐中长期保存,温度稳定可保持菌体活性数年。
② 若仅需短期保存(1–3个月),可暂存于–20 ℃冰箱,但长期存放建议仍转移至–80 ℃或液氮环境,以防反复冻融造成损伤。
③ 冻存过程中避免频繁开关冰箱门,确保温度恒定;同时记录冻存位置,便于后续快速查找与取用。
三、注意事项