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[分享] 甘油保菌实验

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发表于 2025-7-11 10:39 | 显示全部楼层 |阅读模式

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一、实验准备


1、试剂与材料

新鲜菌液:选择处于对数生长期、无污染的菌液,确保菌体活性良好。

甘油(丙三醇):使用无菌、纯度≥99%的甘油,避免杂质影响保菌效果。

培养基:根据菌种类型选择合适的液体或固体培养基,确保营养成分充足。



2、耗材

100 mL培养瓶(1个):用于菌液的扩大培养或暂存。

无菌EP管(若干):建议选用1.5 mL或2 mL规格,确保密封性良好,避免冻存过程中泄漏。

1000 μL移液器及配套无菌吸头:用于精确移取菌液和甘油,避免交叉污染。



3、仪器与设备

涡旋混匀仪:用于充分混匀菌液与甘油,确保甘油分布均匀,提高保菌效果。

-80℃超低温冰箱:用于长期保存菌种,确保温度稳定,避免反复冻融影响菌体活性。
二、实验步骤



1、冻存液的配制
① 取一个洁净的100 mL培养瓶,依次加入35 mL甘油(纯度≥99%)和15 mL新鲜培养基,配制成70%甘油+30%培养基的混合液。
② 将培养瓶封口后,置于高压蒸汽灭菌锅中,121 ℃灭菌20 min,彻底杀灭杂菌。
③ 灭菌结束后,待冻存液冷却至室温,转移至4 ℃冰箱保存备用,可有效减少高温对甘油和培养基成分的破坏。

2、菌株培养
① 根据目标菌株选择最适培养基:例如大肠杆菌常用LB培养基,链霉菌常用TSB培养基。
② 将菌株接种至相应培养基中,置于适宜温度(如37 ℃或28 ℃)和转速(150–200 rpm)下振荡培养。
③ 监测菌液OD600值,待其达到对数生长期(一般细菌OD600 0.6–0.8)时即可用于保菌,此时菌体活力最高,保藏成功率最佳。
3、菌液分装与混合
① 在1.5 mL无菌EP管侧壁或管盖上清晰标记:菌种名称、保藏日期及操作者信息,方便后续追溯。
② 使用移液器依次向EP管中加入0.5 mL冻存液和0.5 mL菌液(1:1体积比),最终甘油浓度约为35%。
③ 充分混匀:
• 方法一:用1 mL移液枪轻柔吹打10–15次,避免产生大量气泡;
• 方法二:将EP管置于涡旋混匀仪上,调整适当倾斜角度,使液体形成均匀漩涡,直至呈现均一乳浊状。
④ 混匀不充分会导至菌体分布不均、冻存损伤加剧,显著降低复苏存活率,务必保证混合彻底。

4、菌液冻存
① 将混匀后的冻存管直接放入–80 ℃超低温冰箱或液氮罐中长期保存,温度稳定可保持菌体活性数年。
② 若仅需短期保存(1–3个月),可暂存于–20 ℃冰箱,但长期存放建议仍转移至–80 ℃或液氮环境,以防反复冻融造成损伤。
③ 冻存过程中避免频繁开关冰箱门,确保温度恒定;同时记录冻存位置,便于后续快速查找与取用。
三、注意事项



1、甘油灭菌方式
纯甘油(100%)黏度高、沸点高,直接高压灭菌易导至灭菌不彻底或瓶体变形。建议先将甘油稀释至70%左右(v/v),再进行121 ℃、20 min高压灭菌,以保证灭菌效果并减少安全隐患。

2、分装体积
每管推荐装液量0.5–1.0 mL。体积过小易造成蒸发损失,体积过大则冻结速度不均,形成冰晶损伤菌体。若需大量保藏,可多管分装而非单管增大体积。

3、冻存液浓度优化
甘油终浓度通常控制在15–35%(v/v)。不同菌种对甘油耐受性差异较大,建议通过预实验确定最佳浓度,以兼顾冻存保护效果与菌体活性。对敏感菌株,可尝试添加5–10% DMSO或0.1 M海藻糖作为辅助保护剂。

4、避免反复冻融
反复冻融会形成大冰晶,破坏细胞膜结构,显著降低存活率。建议:
• 一次冻存、分装多管,每次复苏只取所需数量;
• 取用后立即将剩余冻存管放回–80 ℃,减少温度波动;
• 若需频繁使用,可制备“工作管”与“备份管”分开管理。

5、快速复苏与后续培养
• 将冻存管直接浸入37 ℃水浴,轻轻摇动,使其在1–2 min内完全融化;
• 融化后立即将菌液转入5–10倍体积的预热新鲜培养基中,稀释甘油浓度,减轻渗透压冲击;
• 复苏后首次培养可适当延长复苏时间或降低转速,帮助菌体恢复;
• 若菌株为厌氧或特殊营养需求,应使用相应培养条件并加入必要的生长因子。
6、记录与管理
• 建立电子或纸质冻存档案,记录菌种名称、冻存日期、甘油浓度、复苏状态等信息;
• 定期抽检复苏率,及时淘汰活性下降的菌株,确保菌种库质量。
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