甘油保菌实验

生物科研实验室

一、实验准备


1、试剂与材料

新鲜菌液：选择处于对数生长期、无污染的菌液，确保菌体活性良好。

甘油（丙三醇）：使用无菌、纯度≥99%的甘油，避免杂质影响保菌效果。

培养基：根据菌种类型选择合适的液体或固体培养基，确保营养成分充足。



2、耗材

100 mL培养瓶（1个）：用于菌液的扩大培养或暂存。

无菌EP管（若干）：建议选用1.5 mL或2 mL规格，确保密封性良好，避免冻存过程中泄漏。

1000 μL移液器及配套无菌吸头：用于精确移取菌液和甘油，避免交叉污染。



3、仪器与设备

涡旋混匀仪：用于充分混匀菌液与甘油，确保甘油分布均匀，提高保菌效果。

-80℃超低温冰箱：用于长期保存菌种，确保温度稳定，避免反复冻融影响菌体活性。
二、实验步骤



1、冻存液的配制
① 取一个洁净的100 mL培养瓶，依次加入35 mL甘油（纯度≥99%）和15 mL新鲜培养基，配制成70%甘油＋30%培养基的混合液。
② 将培养瓶封口后，置于高压蒸汽灭菌锅中，121 ℃灭菌20 min，彻底杀灭杂菌。
③ 灭菌结束后，待冻存液冷却至室温，转移至4 ℃冰箱保存备用，可有效减少高温对甘油和培养基成分的破坏。

2、菌株培养
① 根据目标菌株选择最适培养基：例如大肠杆菌常用LB培养基，链霉菌常用TSB培养基。
② 将菌株接种至相应培养基中，置于适宜温度（如37 ℃或28 ℃）和转速（150–200 rpm）下振荡培养。
③ 监测菌液OD600值，待其达到对数生长期（一般细菌OD600 0.6–0.8）时即可用于保菌，此时菌体活力最高，保藏成功率最佳。
3、菌液分装与混合
① 在1.5 mL无菌EP管侧壁或管盖上清晰标记：菌种名称、保藏日期及操作者信息，方便后续追溯。
② 使用移液器依次向EP管中加入0.5 mL冻存液和0.5 mL菌液（1:1体积比），最终甘油浓度约为35%。
③ 充分混匀：
• 方法一：用1 mL移液枪轻柔吹打10–15次，避免产生大量气泡；
• 方法二：将EP管置于涡旋混匀仪上，调整适当倾斜角度，使液体形成均匀漩涡，直至呈现均一乳浊状。
④ 混匀不充分会导至菌体分布不均、冻存损伤加剧，显著降低复苏存活率，务必保证混合彻底。

4、菌液冻存
① 将混匀后的冻存管直接放入–80 ℃超低温冰箱或液氮罐中长期保存，温度稳定可保持菌体活性数年。
② 若仅需短期保存（1–3个月），可暂存于–20 ℃冰箱，但长期存放建议仍转移至–80 ℃或液氮环境，以防反复冻融造成损伤。
③ 冻存过程中避免频繁开关冰箱门，确保温度恒定；同时记录冻存位置，便于后续快速查找与取用。
三、注意事项



1、甘油灭菌方式
纯甘油（100%）黏度高、沸点高，直接高压灭菌易导至灭菌不彻底或瓶体变形。建议先将甘油稀释至70%左右（v/v），再进行121 ℃、20 min高压灭菌，以保证灭菌效果并减少安全隐患。

2、分装体积
每管推荐装液量0.5–1.0 mL。体积过小易造成蒸发损失，体积过大则冻结速度不均，形成冰晶损伤菌体。若需大量保藏，可多管分装而非单管增大体积。

3、冻存液浓度优化
甘油终浓度通常控制在15–35%（v/v）。不同菌种对甘油耐受性差异较大，建议通过预实验确定最佳浓度，以兼顾冻存保护效果与菌体活性。对敏感菌株，可尝试添加5–10% DMSO或0.1 M海藻糖作为辅助保护剂。

4、避免反复冻融
反复冻融会形成大冰晶，破坏细胞膜结构，显著降低存活率。建议：
• 一次冻存、分装多管，每次复苏只取所需数量；
• 取用后立即将剩余冻存管放回–80 ℃，减少温度波动；
• 若需频繁使用，可制备“工作管”与“备份管”分开管理。

5、快速复苏与后续培养
• 将冻存管直接浸入37 ℃水浴，轻轻摇动，使其在1–2 min内完全融化；
• 融化后立即将菌液转入5–10倍体积的预热新鲜培养基中，稀释甘油浓度，减轻渗透压冲击；
• 复苏后首次培养可适当延长复苏时间或降低转速，帮助菌体恢复；
• 若菌株为厌氧或特殊营养需求，应使用相应培养条件并加入必要的生长因子。
6、记录与管理
• 建立电子或纸质冻存档案，记录菌种名称、冻存日期、甘油浓度、复苏状态等信息；
• 定期抽检复苏率，及时淘汰活性下降的菌株，确保菌种库质量。