分享下自己的一些WB小经验

生物科研实验室

其实主要就是两点：信噪比，也就是信号强，噪音低。（背景，非特异性结合低）

♻️信号强：
1、蛋白样品浓度一定要足够，一般上样20-30 ug，不好跑的蛋白可以到50ug，例如磷酸化蛋白。
2、保证蛋白质量够的同时，上样量要少，1.0-15孔的板最好不要超过12ul，1.5-15孔的板最好不要超过15ul。
3、每个孔上样量要一致！！！如果因为调内参导至上样量有差别，那就补齐！用loading给上样少的补到一样体积！！（具体操作之后出个视频）
4、🉑先10v跑20min，再开始85v跑上层，130v跑下层。（自制胶适用，预制就按预制说明做即可）
5、转膜小分子蛋白用0.22的膜，理论上1kd 1min，比理论上再多10min即可，恒压90v或恒流300mA都可以。
6、敷一抗：两张膜可以背靠背孵育，可以敷的很均匀。

🌟ps ：一抗的选择很重要！如果不知道选择什么牌子的一抗就去查CiteAb网站，这个很好用。

‼️噪音低：
1、封闭时间要够，脱脂奶粉1小时起步，不要用变质有析出的奶粉，磷酸化蛋白用BSA或者快封封闭，封闭完空洗膜10min再敷一抗！会干净很多。
2、洗膜的时候一抗洗久一点，二抗正常洗，另外，一抗4度过夜孵育比常温孵育效果好，4度孵育最好超过9个小时。
3、二抗常温孵育1h即可，不好孵育的蛋白可适当延长时间。
4、曝光，一定要选择好用的发光液，尤其是本底含量本身就比较低的蛋白。