ELISA 实验操作注意事项是什么？

空白派

ELISA 实验操作注意事项是什么？
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队长是我

洗板

固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。洗板对于ELISA测定来说，是极其关键的一步。洗液尽量不要溢出孔外；加洗液后要静置1分钟，甩去板孔中洗液后，大力拍干；及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能影响试验结果。
边缘效应

使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深。经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。因此使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37℃），就可以很容易地排除“边缘效应”
显色

显色一定要控制时间,一般来说，显色时间过短，结果偏低；显色时间过长，空白增高或者非特异性显色增加。
比色

比色要注意波长的选择。以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。
其次，单波长或双波长比色选择的问题。单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和；非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非常感波长下的吸光度值的差。因此，双波长比色测定具有能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。
综上所述：尽管ELISA测定操作步骤简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步之中，尤以加样、温育和洗板为甚，小伙伴们在做实验时多多留意。

长长的路

一、实验前将所有试剂平衡至室温，包括样本、TMB（非常重要）。
二、强烈建议老师在操作的时候每个样本包括标准品做复孔（请务必这样操作），因为这样可以：求平均值，确保实验结果的准确性对试剂盒的性能进行评估 对自己的操作进行评估解决跳孔
三、为保证老师 ELISA 实验结果准确 ，其中几点重要的操作注意事项请务必参考：如果以下表述与说明书中不一致，请按照实验对应说明书的要求操作 。
1、标准品溶解：标准品溶解严格按照说明书进行操作，建议老师进行标准品稀释时，在EP管中进行。
2、孵育：说明书中进行孵育的时候，一定要用微孔板振荡器振荡，这个很重要，利于抗原抗体充分结合。
3、洗板：建议按照说明书操作，每次洗涤至少洗液浸泡30s，重复6次，洗板时间太短、次数太少会导致实验效果不佳，延长洗板时间和增加洗板次数可以使背景更干净。
4、如何控制标曲显色？(仅针对双抗夹心法ELISA试剂盒)5 .30分钟显色时间为经验范围，每个具体的实验，可根据以下情况，确定大致的显色时间：
1) 肉眼观察：标曲S5孔有淡蓝色、Blank孔无明显蓝色时，即可终止。
2) 仪器判断：630 nm左右波长下，标曲S1孔的OD值达到0.5 - 0.7、S5孔的OD值达到0.05 - 0.08、Blank孔的OD值小于0.05时，即可终止。
3) 高敏系列试剂盒因灵敏度更高，需严格控制显色时长，可较普通试剂盒适当缩短显色时间。