高分辨质谱的所测质量数如何保证准确？

空白派

如果母离子质荷比跟理论值比，相差d，那么所有子离子都应该跟理论值相差d吗？高分辨质谱偶然误差能有多少？重复测6次RSD能有多少？

原文地址：https://www.zhihu.com/question/9157090692

检验医师

文章来源：Poster @ASMS 2025
作者：1. Adam Graichen，康涅狄格大学化学系；2. Yongdong Wang，Cerno Bioscience
未知化合物的鉴定极大地受益于高分辨率（HiRes）质谱系统不断提高的质量准确度能力。不幸的是，由于各种硬件 / 固件 / 软件因素，除了有限的情况外，唯一确定完全未知物元素组成的 “圣杯” 仍然难以实现。
虽然已知高分辨率质谱能够轻松实现 1-5ppm 甚至更好的质量准确度测量，但这些仪器缺乏谱图准确度（Spectral Accuracy，SA），而谱图准确度有助于进一步排除不正确的元素组成。矛盾的是，低或较低分辨率（LowRes）质谱虽然通常具有较低的可实现质量准确度，但却具有较高的谱图准确度。
在本文中，我们展示了在一次分析中利用高分辨率和低分辨率测量的可行性，通过利用现有 Orbitrap LC/MS 系统上可用的高分辨率和低分辨率扫描能力，在同一次进样和数据采集中实现独特且高置信度的元素组成测定！


方法
1. 实验仪器及材料
LC/MS仪器：赛默飞 Orbitrap Exploris 480 和 Vanquish UPLC，
色谱柱： ThermoFisher Accucore C18（2.6 μm，100×2.1 mm）

样品：Restek 31977（LC 多残留农药标准品 #6，有机氮化合物，100 μg/mL，乙腈），稀释至 500 ppb。
软件：Xcalibur 软件（赛默飞）、MassWorks 软件（Cerno Bioscience）
2. 实验条件
色谱柱：流速 0.3 mL/min，温度 40°C。
流动相 A：水 + 0.1% 甲酸，流动相 B：乙腈 + 0.1% 甲酸。梯度洗脱（B 相）：0-1 分钟 1%，1-5 分钟 25%，5-15 分钟 60%，15.1-19 分钟 90%，19.1-20 分钟 1%。
质谱数据采集：ESI+模式
全扫描质谱，高分辨率 120K 分辨力（RP），自动增益控制（AGC）目标 1e6，50-500 Da ；
数据依赖型（DDA）全扫描 MS2：10 个离子，15K 分辨力，0.50Da 窗口，AGC 目标 1e5 ；
全扫描质谱，低分辨率 15K 分辨力，AGC 目标 1e6，50-500 Da。
使用赛默飞 Xcalibur 软件进行后处理，使用 Cerno MassWorks 软件进行 sCLIPS（自校准线形同位素轮廓搜索）谱图准确度分析。

结果与讨论
使用 Xcalibur 软件和精确质量提取离子色谱图（XIC），在采集的运行数据中确认了 28 种预期化合物中的 26 种，其预期保留时间（RT）位置已确定，如表1总结及其他分析结果所示。



表1：28种化合物的分析结果

120K 和 15K 分辨率下的质量误差和标准偏差
在每个确定的保留时间窗口内，使用 120K 和 15K 分辨力下最多 3 个最丰富的全扫描质谱来报告每个分辨力下的精确单同位素质量值，将每个平均精确质量与理论精确质量进行比较，计算质量误差（偏差）以及每个分辨力下的相应标准偏差，如图1和图2所示。




图1：在 120K 分辨力下的质量误差和标准偏差

在 120K 分辨力下，所有质量误差均为正值且 < 0.6 mDa（除了错误识别的化合物 #13），而标准偏差小 2-3 倍或 < 0.2mDa，这表明在 120K 分辨力下系统质量误差占主导地位，除非不可能，否则进一步改进的可能性不大。尽管如此，这使得在狭窄的 1mDa 质量窗口内搜索未知元素组成成为可能，但仅凭这一点甚至不足以接近唯一鉴定，26 种检测到的化合物的候选分子式的平均个数为 86。




图2：在15K 分辨力下的质量误差和标准偏差

在 15K 分辨力下，质量误差和标准偏差均增加，并且由于标准偏差较大，现在出现了负质量误差。在 15K 分辨力下，使用狭窄的 1mDa 质量窗口进行可靠的未知元素组成搜索是不可行的。幸运的是，有更准确的 120K 分辨力质量测量可用，可以取而代之。
120K 和 15K 分辨率下的谱图准确度

如表1的所示的结果中，120K分辨率下产生的同位素谱图准确度要明显差于15K分辨率的谱图准确度，因此导致了在鉴定一些化合物的分子式时的排序不佳，如化合物2，120K分辨率的谱图准确度为96.3%，分子式在940个后选中排第三，而15K分辨率的谱图准确度提升至98.4%，分子式排序也提升至第一位。谱图准确度对正确分子式的鉴定能力
为了将这些测试化学品视为真正的未知有机化合物，设计了一个宽松的元素组成搜索条件，包括所有合理预期的元素，并使用关于每种元素可能的原子数及其比例的最广泛经验规则，如2表所示。



表2：sClPS检索条件

在MassWorks软件的sCLIPS检索分析结果中，对于每种检测到的化合物，从 120K 和 15K 分辨力中选择最丰富的扫描用于 sCLIPS 元素组成测定。对于 120K 扫描，使用其自身的精确质量，而对于15K 扫描，采用 120K 扫描的精确质量来搜索所有可能的元素组成，并按谱图准确度从高到低对列表进行排序。
如图3所示，化合物22号的精确质量值m/z 284.0719采用120K分辨率质谱图测定，同位素的谱图准确度98.5%由15K分辨率的质谱图测定，根据谱图准确度，正确的分子式在全部的82个候选结果中排名第一。




图3：化合物22的精确质量测定（120K）和谱图准确度测定（15K）结果

如表1所示，正确化合物的谱图准确度、其在所有候选分子式中的排名以及与下一个最佳谱图准确度命中的谱图准确度差值（SA breakout）均总结在表中。当正确化合物不是最高命中时，SA breakout 计算为正确化合物与最高命中化合物的谱图准确度差值（负值）。对于所有化合物，从 120K 到 15K 分辨力扫描，谱图准确度本身（中位数 97.4% vs 98.9%）和 / 或 SA breakout（中位数 0.4% vs 1.6%）均显著增加，从而在提高排名的同时增加了鉴定置信度。1.0% 的SA breakout 通常意味着唯一鉴定和模糊鉴定之间的区别，因此非常重要。




图4：化合物14在120K和15K分辨率下的谱图准确度对比及分子式排名对比

以此为基准，在之前的尝试中，我们使用相同的非靶向方法进行数据采集，并使用 GNPS 分析了一组类似的化合物，其仅正确鉴定了 75% 的测试化合物。

结论
如先前发表的文献（参考文献2）所述，即使优于 1mDa 的质量准确度也远远不足以确定真实未知物的元素组成，在此次测试的 26 种检测化合物中，平均的候选分子式个数为 86。
谱图准确度（SA）可以在质量准确度之外显著改善元素组成，在 120K 分辨力（RP）下，26 种化合物中有 23 种在最高 SA 命中中被发现，这与仅使用质量准确度相比是一项壮举。
通过使用 120K 和 15K 分辨力扫描获得了最显著的结果，其中所有 26 种化合物的分子式全部被排序在候选结果中的第一位，而且由于 SA 和 SA breakout 的增加，置信度显著提高，在商用质谱仪上，在相同的一般数据采集条件下，通过单次进样 LC/MS 分析，在色谱时间尺度上实现了真实未知物的独特元素组成测定。
参考文献：
1.Wang, Y et al, Anal. Chem., 2010, 82, 7055-7062(17)
2. Erve,J.etal,JAMSocMassSpectrom., 2009, 20,2058-2069
3. Khodjaniyazova, S. et al, Anal. Chem. 2018, 90, 1897−1906
4. Strife, R. et al, J Mass Spectrom., 2018, 53, 921–926
5. Kind, T. et al, BMC Bioinformatics, 2007, 8:105