WB可以跑2块胶，1块孵目的蛋白，1块孵内参吗？

生物科研实验室

科研实验中，Western Blot（简称 WB）可是检测蛋白质表达的常用 “利器”。它的核心原理就是靠抗原抗体的特异性结合，先让细胞或生物组织样品在凝胶电泳里来个 “大挪移”，然后再着色，这样就能分析出特定蛋白质在细胞或组织里到底有多少 “存货” 了。
常规操作下，WB 实验一般会把目的蛋白和内参蛋白放一块胶上检测。那能不能直接跑两块胶，一块孵目的蛋白，一块孵内参呢？



双胶分孵的潜在问题
（一）实验误差层面 在科研实验里，做WB时，要是用两块胶，问题不少。就说电泳环节，就算用同一台电泳仪，两块胶实际受的电压、电流也难保证完全一样。比如说，电泳槽缓冲液分布有点不均匀，两块胶所在区域电阻就不同，电流分配也就有别。这电流、电压一有差异，蛋白条带在凝胶里迁移速度就变，毕竟蛋白迁移靠电场力，还得克服自身在凝胶里的摩擦力。如果电场力一变，蛋白跑起来速度快慢不同，条带位置就会偏移，这可就影响判断蛋白分子量，后续分析条带灰度值时也容易出错，不同胶间结果就没法好好比较。
再看转膜这一步，两块胶想转膜条件一样也难。转膜效率受转膜时间、温度、转膜液成分和浓度影响。要是转膜时间不一样，蛋白在膜上转移量就有差别，后续测同一种蛋白，信号强弱也不同，这不就干扰实验结果准确性了。转膜温度波动也不行，会影响蛋白活性和膜性质，转膜效果就不好。到了抗体孵育阶段，两块胶在温度、孵育时间上稍有差别，抗体浓度分布也不同，抗体和抗原的结合就会不一致，实验误差又加大了。
（二）内参作用角度 在WB实验里，内参蛋白是个关键角色，要是把目的蛋白和内参蛋白分在两块胶上孵育，内参蛋白的作用就大打折扣。内参蛋白首先得给上样量 “纠偏”，因为蛋白质定量方法和上样操作都有误差，实际各样品上样量很难完全一样。内参蛋白在不同组织和细胞里表达稳定，测它的表达量就能给目的蛋白上样量校正。但分胶的话，同一泳道里目的蛋白和内参蛋白没法直接比，上样量误差就没法准准确校正。比如研究药物对细胞特定蛋白表达影响，若目的蛋白样品上样量比内参蛋白多，又没校正，就容易误以为药物有影响，实际可能是上样量问题。
另外，内参蛋白还能判断蛋白转膜效率。转膜时，各泳道蛋白转膜效率不一，看内参蛋白在膜上的信号强度，能知道蛋白转没转完全、效率有没有偏差。要是分胶，内参蛋白就没法直接评估目的蛋白那块胶的转膜情况，目的蛋白条带信号强弱就不好判断是表达量变化还是转膜效率差异导至的。所以分胶孵育让内参蛋白失了效，实验结果可靠性就大降。
特殊情形下的考量
搞 WB 实验，多数时候把目的蛋白和内参蛋白放一块胶上孵育更稳妥。但有些时候，情况特殊。
就说内参蛋白和目的蛋白分子量差太多的情况。内参蛋白一般表达稳定还量高，目的蛋白可能就量少。分子量差距大，放一张膜上检测，容易出岔子。要么内参蛋白信号太强，盖过目的蛋白；要么为了看清弱的目的蛋白信号，曝光时间拉长，内参蛋白条带就饱和了，看不出真实表达量，这可就干扰了对目的蛋白表达水平的判断。
碰上这种情况，分胶孵育可以考虑。但这只是在把利弊权衡后，无奈才这么干，而且实验条件必须控得严格，不然很容易有误差。

投稿与学术规范要求 投稿的时候，不同期刊对目的蛋白和内参蛋白是否要在同一张膜上的要求不一样。 一般来说，多数杂志不会硬性规定必须放在一张膜上，但有的可能要求你提交整膜的WB条带。像2024年，JCI和它的子刊JCI Insight就要求，如果图里有剪裁过的 Blot/Gel 图像，就得提交所有裁剪印迹和未编辑图像的文件，还得标注「图 [X] 的完整未编辑 Blot/Gel」和对应通道。所以，科研人员投稿前，得仔细看期刊的投稿要求，按规范来。
如果为了省膜、省抗体，把膜裁开分别孵育抗体再曝光，建议每张膜都留个内参，这样比较起来更方便，也能满足学术上对实验严谨性和可重复性的要求。
实验建议与总结 如果目的蛋白和内参蛋白分子量差太多，转完膜后可以按蛋白质 Marker 大小把膜分成大分子量和小分子量两块，把内参蛋白和目的蛋白分开。然后两块膜分别和内参蛋白抗体、目的蛋白抗体孵育，再孵育二抗，最后显色。这种方法既解决了分子量差距大导至的检测难题，又避开了双胶分孵带来的误差风险。
不过，常规实验里，别看双胶分孵在特殊情况下能用，但不建议采用。还是老老实实把目的蛋白和内参蛋白放一块检测靠谱。当然，要是有特殊情况，也可以灵活处理，比如分膜孵育。总之，遵循科学、严谨的实验方法，根据情况灵活用分膜孵育等技巧，才能让实验结果准、可靠，给科研数据撑腰。