【实验技术学习笔记】免疫组织化学染色法（IHC）

空白派

实验室经典技术之一 —— 免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）
Preface

小何最近回顾之前选修的一门课《Laboratory Methods and Instrumentation》（安利给各位港大的小伙伴，如果不讨厌繁重的作业和期末考试。不是港大的小伙伴但也想详细学习这门课，可以跟着小何的实验技术学习笔记一起来学习，更新完毕我会统一放出所有学习ppt link以及相关protocol），这门课将bio领域会遇到的几大基础实验分门别类介绍原理及相关运用，小何个人觉得以下归类方法展开实验室技术学习笔记是个不错的方式，所以接下来会结合港大这门课的老师给的资料和自己实际实验使用的protocols去继续给大家分享带有我个人向的实验技术学习笔记：（以下为接下来几期的内容预告目录，感兴趣的可以持续follow，谢谢各位同学们的关注和鼓励！）当然这都是我个人向的学习笔记，仅供大家参考。

Tissue processing and immunohistochmistry 组织处理和免疫组织化学   
Principle and applications of flow cytometry 流式细胞仪的原理和应用  
Protein analysis methods 蛋白质分析方法  
Mass spectrometry and its applications in biological studies 质谱及其在生物研究中的应用   
Basic concepts in automated DNA sequencing and genotyping 自动化的DNA测序和基因分型的基本概念
Mutation detection technologies 突变检测技术   
Epigenetics and methylation analysis 表观遗传学和甲基化分析  
Animal models for research 动物模型的研究   
Cancer stem cells: Methods and protocols 癌症干细胞:方法和协议

概念介绍

免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）。
即带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞与对应组织结合化学反应显色，对其进行定位、定性及定量的研究：


它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜（包括荧光显微镜、电子显微镜）的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质（如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等）。



本章Outline

免疫组织化学中抗体选择要点：
1、抗体（单抗/多抗）和标记物选择及准备（注意：多抗比单抗便宜，实验室预算很重要）
多抗和单抗特性比较：1.均一性。一种单抗中，每个抗体的化学结构和氨基酸顺序都相同，只有一种Ig亚类。即单抗是一种纯度很高的均一抗体。而从不同动物，不同时期所得到的多抗，各有不同的化学组成。多抗是多种种类和亚类Ig的混合物 2. 稳定性。单抗的稳定较差，对PH变化敏感，对热不稳定，提纯过程中易变性，而多抗的稳定性则较好。3. 特异性。单抗是单一地针对抗原的某一决定簇，所以用它进行血清学反应时，特异性强，敏感性高，一般不发生交叉反应。而多抗能与抗原上的多种抗原决定簇结合，所以特异性较差，较易引起交叉反应。4.重复性。单抗的重复性好，而多抗每批都不一样。5. 沉淀反应。多抗由于与抗原多价结合容易形成网络样沉淀，而单抗只与抗原结合产生二聚体，不能直接形成抗原抗体沉淀物。


2、免疫细胞化学标记技术（labelling technic）：免疫荧光法（Immunofluorescence）【要求新鲜标本】，免疫酶促技术(Immunoenzymatic technique)【不要求新鲜标本，包括免疫过氧化物酶法（Immunoperoxidase Approach）、生物素-亲和素免疫酶技术（Biotin-Avidin Immunoenzymatic Technique)，实验室多用后者】、放射性元素法（Radioactive element）、胶体金法（Colloidal gold）、聚合物法（Polymer approach）
标本的制备

目前主要有三种方法制备：冰冻切片，石蜡切片，涂片法。
冰冻切片：某些细胞抗原无法在常规固定和石蜡包埋中存活。其实验方法原理是冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。缺点： ➢ 形态差 ➢ 在更高放大倍数下分辨率差 ➢ 需要特殊存储 ➢ 有限的回顾性研究 ➢ 石蜡切片切割困难冰冻切片实验材料：新鲜组织
冰冻切片

试剂、试剂盒：H2O2 酒精 丙酮 PBS DAPI工作液 中性树胶
仪器、耗材：OCT速冻架恒冷箱切片机烘箱荧光显微镜
实验步骤：

一取材
应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。
二速冻
1、将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。
2、如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。
3、当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
4、在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。
5、若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。
三固定
1、样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。
2、取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。
3、组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。
四切片
1、恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。
2、切片时，低温室内温度以-15℃ ~ -20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。
3、切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5-10min，烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。
4、进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5-10min，消除内源性过氧化物酶的活性。
五免疫荧光染色
1、冰冻切片室温晾干15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可不洗）。
2、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸）。
3、将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。
4、第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。
5、滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次。
6、滴加DAPI工作液染核，室温10-20min（工作浓度0.1%染色15min）。
7、回收DAPI，滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。
8、做好的切片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。

石蜡切片

实验材料：新鲜组织
试剂、试剂盒：染色缸；染色架；保湿盒；晾片盘；微量移液器；0.2MPBS，乙醇，二甲苯，BSA，中性树胶等
仪器、耗材：OCT速冻架恒冷箱切片机烘箱荧光显微镜

实验步骤：
1、石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟；
2、脱蜡和水化：二甲苯(10min)→二甲苯(10min)→无水乙醇(5min×2次)→95%乙醇(5min×2)→90%(5min)→85%乙醇(5min) →80%乙醇(5min) →75%乙醇(5min)；
3、蒸馏水冲洗2次5min；
4、加3%H2O2孵育30min(室温)；
5、蒸馏水洗2次；
6、抗原修复：高压修复或微波修复｜柠檬酸修复液：柠檬酸0.4g 柠檬酸钠3g配成1000ml高压修复：高压2min；微波修复：预热5min，高火4min，中火5min；
7、PBS洗3次各5min，封闭30min；
8、滴加一抗，4℃过夜或37℃孵育2~3h；
9、PBS冲洗3次各5min；
10、滴加二抗，37℃孵育30~60min；
11、PBS洗3次各5min；
12、DAB显色，自来水充分冲洗；
13、苏木素复染，自来水充分冲洗；14、脱水、透明各5~10min；
15、封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干。

三种制片方法比较--from abcam.com

抗原修复

对甲醛固定的组织切片进行抗原修复，以暴露抗原位点，从而使抗体结合。

甲醛固定会导致蛋白质交联（亚甲基桥），从而掩盖抗原表位，而且可能会限制抗原-抗体的结合。抗原修复方法则会破坏这些亚甲基桥，暴露出抗原表位，允许其与抗体结合。冷冻组织切片通常不够坚固，进行抗原修复时会损坏切片。人们一般会避免用甲醛固定剂固定冷冻切片（或者在使用时大大减少暴露时间），从而省去/减少抗原修复步骤的需求。
抗原修复：通过破坏由福尔马林固定形成的蛋白质交联并揭示隐藏的抗原位点来改善抗原的展示；有以下两种抗原修复的方法。
• 热诱导表位修复 ：微波炉、压力锅和蒸锅。
• 酶诱导表位修复 ：柠檬酸缓冲液 (pH 6)、TRIS-EDTA (pH 9)、EDTA (pH 8) 、 蛋白酶 K、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶
热诱导表位修复

（1）高压热修复：在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）煮沸热修复：电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
（3）微波热修复：在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
注意事项
抗原修复时必须保证切片始终能浸泡在液体内，一定要等工作液冷却后才能将切片取出。
酶诱导表位修复

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。



抗原修复主要方法比较--from abcam.com

封闭/阻断

阻断蛋白质

用血清或蛋白封闭，防止非特异性抗体结合，并减少背景和潜在的假阳性结果。

使用血清或蛋白封闭液进行封闭对防止抗体与组织或 Fc 受体（与抗体恒定区（Fc）结合的受体）的非特异性结合至关重要。与二抗种属匹配的血清是很好的封闭液。蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或酪蛋白，可用于阻断非特异性抗体结合。建议在使用基于亲和素/生物素的检测系统时，阻断内源性生物素，因为内源性生物素存在于许多组织中，尤其是肾、肝和大脑中。用亲和素孵育组织前，先阻断内源性生物素，然后用生物素孵育，以阻断抗生物素蛋白分子上的额外生物素结合位点。
如果使用与样本种属相同的一抗（例如，小鼠组织上的小鼠抗体），则应采用抗该种属的二抗的 F(ab) 片段进行封闭。F(ab) 片段结合并浸润组织切片中的任何内源性抗体，阻断二抗的结合。但是，这种 F(ab) 方法不能完全阻断，并且会留下一些背景。
阻断内源性酶

使用酶检测方法，需阻断内源性酶，以免混淆您的结果。使用一抗孵育后，需考虑阻断内源性酶，因为像 H2O2这样的处理会破坏抗原表位，影响结合。如果您的抗体是 HRP一抗偶联物，那么在加入一抗之前，需要先完成阻断处理。

显色检测法通常使用与二抗偶联的酶来显示抗体位置。如果组织样本中也有内源性酶活性，开始检测前必须阻断内源性酶，这一步至关重要。
      过氧化物酶封闭:使用辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗体进行检测时，内源性过氧化物酶活性可能会导致非特异性或高背景染色。一抗孵育前，用 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）底物孵育组织，检查内源性过氧化物酶活性。如果组织变成棕色，表明存在内源性过氧化物酶（比如通常在组织血管的红细胞中发现），需要进行阻断步骤。过氧化氢（H2O2）是最常用的过氧化物酶封闭剂。
    碱性磷酸酶封闭:使用内源性碱性磷酸酶（AP）偶联抗体进行检测时，AP 会产生高背景染色。用 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/氯化硝基四氮唑蓝（BCIP/NBT）孵育组织后，可检测组织中的内源性 AP。如果观察到蓝色，表明存在内源性 AP，需要进行阻断。可用的碱性磷酸酶抑制剂包括盐酸左旋咪唑、盐酸噻咪唑等。
总结：
（1）如果是背景非特异性染色：由于被动吸收血清蛋白和抗原扩散，通过正常血清封闭降低。 如用山羊血清进行封闭处理。
（2）内源性过氧化物酶活性：通过在孵育一抗前用过氧化氢酶预处理组织切片而降低。
（3）内源性碱性磷酸酶活性：被左旋咪唑预处理组织切片所阻断
（4）内源性生物素：在肝脏和肾脏等组织中 → 生物素-亲和素检测系统中的非特异性亲和素结合 ，通过预处理未结合的亲和素进行封闭，然后用生物素饱和。
（5）自发荧光：某些组织中存在天然荧光 → 如果使用荧光标记则为背景荧光，抗体孵育前用荧光显微镜观察组织切片。
抗原抗体检测

一抗

设计 IHC 实验的关键在于一抗的选择，因为免疫染色的成功需要借助与靶抗原特异性结合的一抗。

直接检测与间接检测：选择一抗之前，您需要考虑使用直接检测还是间接检测方法。检测抗体时，可以直接通过与一抗偶联的标记进行检测，也可以间接利用在与一抗不同的宿主物种、抗体类型和亚型中培养的标记二抗进行检测。

• 直接检测​
  
  
  
  • 适用于研究高表达的抗原​
    
  • 无需使用二抗进行额外的孵育步骤（因此消除了二抗的任何潜在的背景染色）​
    
  • 增加了多色实验设计的灵活性​
    
  
  
• 间接检测​
  
  
  
  • 适用于所有抗原​
    
  • 信号可用多种方法进一步放大​
    
  • 需要额外的阻断步骤和对照品
    
  
  

选择一抗需要考虑的要点：一抗在什么种属中培养？一抗是否能与目的蛋白结合？是否曾证实一抗在此应用中有效？

抗体特异性
抗体特异性最确凿的证明是，在目的蛋白已被敲除的组织或细胞中缺乏染色。其他指标有

• 信噪比：抗体可能结合正确的蛋白质，但也会有一定的噪音，因此应拒绝信噪比低的抗体
  
• 如果无法进行 KO 验证，并且仅确定定位特异性，则信噪比尤其重要
  
• 染色模式与目的蛋白在对照细胞或组织中的已知定位一致
  
• 已知不表达该蛋白质的组织或细胞缺乏染色。
  
• 免疫印迹中仅看到单一条带
  

二抗--检测和扩增系统​

对于间接检测，二抗是成功显示一抗分布的关键。

与使用标记一抗的直接检测不同，使用二抗和相关检测系统能够扩增信号，因为不止一个二抗分子与单个一抗结合。
显色与荧光检测：可以选使用酶标记的二抗（如 HRP、AP），或选择荧光法（免疫荧光），使用荧光染料标记的二抗（如 FITC、R-PE、Alexa-Fluor®）进行检测。

• 显色法​
  
  
  
  • 生物素标记的二抗和链霉亲和素-HRP 能进一步扩增 ABC 方法中的信号。或者也可以使用现代 HRP-聚合物二抗。​
    
  • 一些沉淀物具有光稳定性（HRP/DAB 具有很好的光稳定性，但 HRP/AEC 在阳光下会褪色），所以载玻片有可能储存多年。​
    
  • 仅需要标准的明场显微镜。​
    
  • 酶/显色剂沉淀物的沉积区域比来自荧光源的光子沉积区域更宽，这可能影响个人解读结果的能力。​
    
  • 该过程通常耗时较长，因为它的孵育和封闭步骤比荧光方法要多 — 但是，情况并非总是如此，具体取决于使用哪种扩增系统。​
    
  • 由于酶的扩增作用，定量一般比较困难。​
    
  
  
• 荧光法​
  
  
  
  • 可在不同波长下激发多个荧光团，同时显示多个抗原（多路复用）。​
    
  • 图像质量更好，分辨率更高。​
    
  • 用酪胺染料标记 HRP 抗体，可以将荧光染料沉积在抗体染色部位，从而将信号扩增。​
    
  • 更适合于信号定量。​
    
  • 对自体荧光敏感，特别是甲醛固定。​
    
  • 更快的实验步骤。​
    
  • 需要更昂贵的成像设备。​
    
  • 随着时间推移，荧光基团的稳定性降低。
    
  
  

酶和显色剂

显色检测中需要考虑的其他因素有酶和显色底物的选择。每种检测酶都有几种不同的显色剂。HRP-DAB 是最常用的显色剂组合。显色剂的一个优点是，可以将其与有机封固剂一起使用，有机封固剂的折射率往往更好，获得的图像更清晰。但是，水介质的使用速度更快，因为无需对切片进行脱水。
免疫组织化学染色整体流程（结合以上）



SP法

1）脱蜡、水化
2）PBS洗2～3次各5分钟；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；
4）PBS洗2～3次各5分钟；
5）抗原修复；
6）PBS洗2～3次各5分钟；
7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10）PBS洗3次各5分钟；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
13）PBS洗3次各5分钟；
14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
15）PBS或自来水冲洗10分钟；
16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
17）自来水冲洗10～15分钟；
18）脱水、透明、封片、镜检。
SABC法

1)脱蜡、水化。
2)PBS洗两次各5分钟。
3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。
4)抗原修复。
5)PBS洗5分钟。
6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。
7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。
8)PBS洗三次每次2分钟。
9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。
10)PBS洗3次每次2分钟。
11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。
12)PBS洗4次每次5分钟。
13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
14)蒸馏水洗。苏木精复染2分钟、盐酸酒精分化。
15)脱水、透明、封片、镜检。
免疫组织化学法应用

• 恶性肿瘤的诊断
• 肿瘤细胞类型的鉴定
• 预后
• 感染的诊断
• 肾脏病理
• 淋巴病理
• 预测靶向治疗的使用
• 其他实验室技术中的辅助工具



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