实时荧光定量PCR技术

生物科研实验室

荧光定量PCR（qPCR）技术自其诞生以来，已经在分子生物学、临床诊断、环境监测等多个领域发挥了重要作用。今天，小助手和大家一起来聊聊实时荧光定量PCR技术~
一、PCR的发展历程1、1983年美国科学家Kary Mullis发明PCR方法，用于放大扩增特定的DNA片段，可看作是生物体外的特殊DNA复制。2、1985年，Cetus公司从温泉中分离的嗜热菌（Thermus
aquaticus）株中纯化出耐热DNA聚合酶（后面简称Taq酶）。该酶耐高温的性质极大地提高了PCR扩增的效率，使得PCR真正变为现实，为其自动化铺平了道路。但是PCR技术也有其相应的局限性，就是对扩增产物分析时需要开盖处理，容易造成污染。为了解决这一问题Russ
Higuchi进行了一系列相关研究。3、1992年，Higuchi在一次报告中提出了实时荧光定量PCR技术。通过检测溴化乙锭的含量实时监控整个PCR反应的进程。之后经过不断的研究，通过对PCR反应的数学函数关系、相应的算法以及对标准品的运用，就可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。4、1996年ABI公司推出世界上第一台定量PCR仪7700型。设备由荧光定量系统和计算机组成，通过荧光染料或荧光探针，对PCR产物进行标记跟踪，结合相应的软件对结果进行分析，可以实现计算待测样品的初始模板量。由此，实时荧光PCR技术开始更广泛的应用。
二、荧光染料法原理在PCR反应体系中，加入可与双链DNA小沟区域结合的荧光染料，荧光染料在游离状态下几乎不发出荧光信号，与双链DNA结合后发出强烈的荧光信号。PCR扩增时，每形成一条双链，就有相应染料与双链DNA结合，产生荧光信号，检测到的荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。
三、荧光探针法原理在PCR反应体系中，加入一对引物和一个特异性的荧光探针，探针的5′端标记一个报告基团，3′端标记一个淬灭基团。探针完整时，报告基团的荧光信号被淬灭基团所淬灭，检测不到荧光信号，探针水解后，报告基团逃离淬灭基团的淬灭范围，发出荧光信号。PCR扩增时，引物和探针同时与模板特异性结合，当延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5'端外切酶活性将探针水解切割，报告基团和淬灭基团分离，荧光信号开始积累。每形成一条DNA双链，就会切断一个探针，释放一份荧光信号，检测到的荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。常用的荧光探针为TaqMan探针。