实验难题 | 中药含药血清如何制备？以及在动物选择、给药方式和采血时间上怎么确定？

生物科研实验室

1实验动物选择原则在选择用于血清药理学实验的动物时，需确保体外培养细胞能在该动物血清中良好生长且形态正常，对照组血清质量需保持稳定，且血清添加量高。为减小或避免动物血清与人血清在理化及生物特性上的差异，应优先选择与人类生物特性相近的动物。离体器官、组织、细胞的供体动物与含药血清的供体动物应尽量保持一致来源，故大鼠与小鼠常被选用。
此外，有学者指出，临床患者多处于某种病理状态，而中药在病理状态动物体内的作用部位有效成分血药浓度与正常状态有所差异。通过对比正常与病理状态下大鼠灌胃（ig）清肝化瘀方药后的含药血清对肝癌细胞SMMC-7721的作用，发现前者仅轻微抑制，而后者则显著抑制并能诱导肝癌细胞凋亡，提示病理状态下大鼠血清中的有效成分及浓度可能发生变化，对肿瘤细胞抑制作用更强。
然而，李丹等在研究心肌缺血模型大鼠与正常大鼠灌胃双参宁心方后的血清对缺氧/复氧H9C2细胞的影响时，发现两者含药血清均能提高H9C2细胞活力，但正常大鼠含药血清组的细胞总体活力更强。因此，选用健康动物还是模型动物仍需进一步探讨。2给药方案的选择（1）给药剂量考量：将含药血清视为一种药物时，其给药剂量主要受两方面因素影响：首先是动物的给药量，其次是培养体系或反应体系中含药血清的实际浓度。动物给药量的计算遵循以下公式：给药剂量 = 人临床用量 × 动物等效剂量比值 × 培养液中血清稀释度。在实际操作中，由于给药浓度和体积的限制，给药剂量需结合具体药物的量效关系研究进行灵活调整，不可盲目套用。
关于含药血清浓度的确定，关键在于确保体外培养体系中药物浓度与体内血药浓度相当，同时不影响所培养组织、细胞的正常生长。为此，有学者创新性地将含药血清制成冻干粉，通过以冻干粉形式加入反应系统，能够更精确地控制含药血清的浓度，满足实验需求。
(2) 给药与采血时间安排：鉴于中药成分的复杂性及其各组分在理化性质、体内代谢过程上的差异，导至药动学参数多样，难以制定统一的给药频次与采血时间标准。目前，存在几种基于经验的给药方案：1）7～10日给药法，即每日给药1次，持续7～10日；2）三次给药法，连续给药三次，首次与第二次间隔20小时，第二次与第三次间隔4小时；3）两次给药法，首次给药后2小时，以相同剂量再次给药。
采血时间通常安排在最后一次给药后的0.5～3小时内，一般不超出6小时。采血过早，可能导至部分药物成分尚未被吸收进入血液；采血过晚，则部分药物成分可能已在体内发生转化或被排泄，因此，理想的采血时机应选择在药物达到稳态血药浓度的时间段内。有研究者在对大量中药药动学参数进行深入分析后，提出了一个适用于中药血清药理研究的通用给药方案：每日给药2次，连续3日，于末次给药后1小时采血。在进行血清药理学实验前，可参考这些经验给药方案，并结合具体药物的药效动力学研究结果，以确定最佳的给药与采血时间。3血清处理考量血清内含有酶、抗体、补体、细胞因子等多种生物活性物质，这些成分可能对体外培养的组织、器官、细胞、病毒及病原菌等产生直接效应，进而干扰实验结果，影响对药物疗效的客观评估。为减少血清带来的非药理学干扰，并满足细胞培养中减少微生物污染的要求，多数研究者选择对含药血清进行灭活处理。常用的灭活方法是56℃水浴加热30分钟，此法能有效去除血清中的补体等干扰实验的活性成分。另有研究者采用乙醇、丙酮等有机溶剂处理含药血清，通过使蛋白质变性来去除酶、激素等，旨在保留药物的原有作用。
然而，有学者对比了无蛋白血清与正常血清与药物的结合情况，发现无蛋白血清中游离药物量较少，这表明处理后的血清可能与体内实验及临床用药的实际情况存在差异。含药血清在处理上面临两难选择：若不灭活，虽能最大程度保留各种活性物质，但难以排除血清中原有生物活性物质对中药成分的潜在干扰；若进行灭活，则可能同时去除药物诱生的活性成分，导至血清药效减弱。
因此，为平衡这一矛盾，可设置空白血清组作为对照，或根据实验所选指标及药物本身的性质来综合判断含药血清是否需要灭活处理。