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[分享] 质谱法怎么解谱?

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发表于 2024-10-13 07:03 | 显示全部楼层 |阅读模式
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发表于 2024-10-13 07:04 | 显示全部楼层
EI源(Electron Ionization)是强电离源,常用于气相色谱质谱联用(GC-MS)。ESI源(Electron Spray Ionization)是软电离源,常用于LC-MS。
下面分别用例子来说明这两种典型质谱的解谱。
(1)EI源质谱的解谱
EI源质谱在相当长时期内作为多级质谱研究的核心,人们也总结了很多有用的裂解规律,包括麦氏重排、氮规则和偶电子规则等。
这些经验规则在一定程度上帮助人们加深理解化合物的裂解行为,而实际工作中,待测物一般不是完全的未知物,也会有其他的检测手段辅助,进行相互验证。
抓住一条最基本的有机物裂解规律,先从脆弱的化学键开始断裂,总结起来就是一句话“麻绳专挑细处断”。
下图是三碘代戊烷的样品做GC-MS后得到的谱图,在NIST数据库中筛选比对后并没有得到理想的结果,Match分数满分是1000,只得到了584,这种情况下就要自己根据MS图与已有信息进行推断了。
三碘代戊烷中C-I键很脆弱,会一个接着一个断裂,于是得到了下面的MS解析图,需要再辅以NMR才可以确定化合物的结构。



三碘代戊烷的EI源质谱图



三碘代戊烷MS谱图与NIST谱库匹配结果

我们再来看看三氯代戊烷的EI源MS图,这种化合物刚好已经收录进NIST数据库中,所以经GC-MS检测得到的MS图与标准数据库筛选比对后,就准确得到了待测物的结构,如下图匹配分数达到了919。



三氯代戊烷的EI源质谱图



三氯代戊烷MS谱图与NIST谱库匹配结果

(2)ESI源质谱的解谱
ESI源是软电离源,通常得到的是待测物的准分子离子峰,正离子模式下有加合H+、Na+、K+、NH4+等正离子的准分子离子形成,负离子模式下有脱氢或加合各种酸根负离子的准分子离子形成,需要根据样品实际情况进行解析。通常来说,ESI源质谱的解析比较简单直接,下面举例说明



某化合物的ESI+谱图



某化合物的ESI-谱图

GC-MS中除了EI源,还有CI源,关于这两种离子源的区别,请查看 @基石流年 回答“质谱中EI源与CI源的区别有哪些”。
LC-MS中除了ESI源,还有同为软电离源的APCI源,这两种离子源质谱的解析有点类似,在此不赘述。
在质谱的解析中,同位素分布也是鉴定化合物的重要参考信息,不管是在质谱数据库的筛选比对,还是人工判断,都应该将待测物的同位素分布作为重要考察项。
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发表于 2024-10-13 07:04 | 显示全部楼层
2020-09-23
质谱法是一个测带电「离子,ion」的方法,图 1 为基本的硬体组成元件,当分析样品进入质谱仪后,首先在离子源使分析物进行「游离化,ionization」以转换为气相的带电离子,进入质量分析器后,在电场、磁场等物理力量的作用下,侦测器可测得不同离子的「质荷比,mass-to-charge ratio,m/z」,便可从电荷推算出分析物的质量



图 1. 质谱仪的硬件组成元件。

游离源ionization source
1). 电喷洒游离法(electrospray ionization
以质谱分析蛋白质的应用中,前端的游离法最常用的是 ESI MALDI。美国 Fenn 教授在 1984 年首度发表以电喷洒的方法将蛋白质分析物转成离子,其示意图如图 2,当分析物溶液经由施加高电压的毛细管流出时,高压电产生的电场会造成溶液中的正负离子分离;以施加正电场的的毛细管为例,正电荷离子会因为排斥的原理往毛细管出口移动,负离子则远离液体表面,最后在毛细管尖端累积大量的正电荷离子,而形成类似圆锥的带电液滴,我们称之为「泰勒锥,Taylor cone」。此时若加于毛细管的电压够大,这些极微小的带电液滴便会从泰勒锥前端喷洒出来,在带电液滴受电场进入质谱仪之前,溶剂会在飞行的过程中快速挥发,使得体积快速变小。但是原本液滴中的正电荷数目并不会改变,因此带电液滴表面的电荷密度会升高,当在液滴表面的电荷间形成的库伦斥力大于表面张力时,带电液滴会分裂成更小的液滴,在不断重复这个过程之后,分析物便会形成带多价电荷的离子,再进入质量分析器测量其 m/z 值。



图 2. 电喷洒游离法。

2). 基质辅助雷射脱附游离质谱法(matrix-assisted laser desorption ionization
基质辅助雷射脱附游离法则由德国的 Hillenkamp 教授及日本的 Tanaka 先生分别于 1988 年提出,此种离子源主要是由雷射光源和金属样品盘所构成(图 3),将分析样品和基质(matrix)混合后,将样品与基质的混和液均匀点至金属盘之样品槽中,使其混合物在空气中自然风干,待溶剂挥发后,混合液会在金属盘中形成样品─基质的共结晶,再以激光光束照射此固态样品时,结晶中的基质会吸收激光的能量,产生质子并由样品盘中脱附而出,此过程会同时将分析样品脱附气化,产生气相离子,以进入质量分析器测量其 m/z 比值,进而推算其质量。由于基质所扮演的角色有吸收激光能量及将样品离子化的功能,因此,选择基质时除了要配合激光光源的波长外,还需要考虑样品的特性。



图 3. 基质辅助激光脱附游离法。

质量分析器mass analyzer
产生气相离子后,离子即进入质量分析器(图 1)进行 m/z 的测量,近年来商业质谱在蛋白质的分析应用上蓬勃发展,在「灵敏度,sensitivity」、「解析度,resolution」及「精确度,accuracy」等各方面突发猛进,四种常用的质量分析器之构造见图 4,其运作原理分述如下:
1). 飞行式时间质量分析器(time-of-flight analyzer,TOF analyzer
飞行式时间质量分析器是由一飞行管构成(图 4a),游离后,所有的离子经由相同的加速电压进入飞行管, 这些质量不同的离子会得到相同的电位能,电位能会再转换成离子的「动能,kinetic energy」,在无场区中,质量重的离子飞行速度较小、质量轻的离子则有较大的飞行速度, 到达侦测器时会有不同的飞行时间,从飞行时间可推算其质量。此种分析器有两个优点,第一,分析速度快,可结合基质辅助雷射脱附游离法,节省样品分析时间;第二,可以分析的质量范围相当广大,甚至可以到达 mz ~1,000,000对于大分子量的生化样品,可以轻易的侦测



图4. 四种分析蛋白质常用的质量分析器。 (a) 飞行式时间质量分析器;(b) 四极棒质量分析器;(c) 离子阱质量分析器;(d) 傅立叶转换质量分析器。

2). 四极棒质量分析器(quadrupole analyzer
四极棒质量分析器由四根电极所组成,如图 4b。两两相对于 X 轴及 Y 轴的电极则分别通入相位一样的正、负直流电,并同时通入交流电压(无线电频率),在固定的直流电以及交流电压下,只有一定范围质荷比的离子可以通过而到达侦测器,其余的离子则会碰撞到电极棒,失去电荷后被真空系统排出;在一定直流电与交流电压比值下,不断加大直流电压与交流电压,可扫描不同的质荷比,即可得到完整质谱图。对生化样品而言,此种分析器有两个优点:第一、此分析器是利用直流电与交流电压来进行扫描,所以可以在较高压力下( )进行分析,因此可以结合连续式进样法的电喷洒游离法来进行样品分析;第二、扫描范围可以到达 m/z ~6,000,大部分的蛋白质或生化样品电喷洒游离法游离之后,带多重电荷的离子质荷比分布大概就落在 400~6,000 之间,因此相当有利于进行生化样品的分析。

3). 离子阱质量分析器(ion trap analyzer,IT analyzer
离子阱质量分析器由一个环状电极(ring electrode)以及两个端盖电极(end cap electrode)所构成(图 4c)。离子阱质量分析器跟四极棒分析器不同之处在于:离子阱只使用交流电压来进行不同质量离子的扫描,离子在四极棒分析器中,只会受到来自 X、Y 轴的电场,在离子阱分析器中则是加入了 Z 方向的电场,离子会因为受到三个轴的电场影响而被「捕捉,trap」,绕着电场中心以一稳定轨道运动,反之,当我们改变交流电压的大小,会造成与此频率共振的离子不稳定,因此被排出离子阱而进入侦测器,持续改变此交流电压,即可扫描不同质荷比离子。此种分析器最大的优点在于它可以使有兴趣的离子留在分析器中,经由在轨道 运行中与气体碰撞产生碎片,可进行多次「诱导碰撞解离,collisional-induced dissociation,CID」实验;而蛋白质经过酵素水解后所得到的胜肽分子在经过碰撞诱导解离后,可将碎片和电脑资料库中比对碎片,进行蛋白质身分鉴定。

4). 傅立叶转换质量分析器(Fourier transform-ion cyclotron resonance,FT-ICR
此 种分析器主要由极板(plate)以及一高均匀的磁场所构成(图 4d),当离子进入后,由于磁场作用进行「回旋,cyclotron」动作。当离子被两个「激发极板,transmitter plates」激发到适当的回旋半径后,会经由感应作用在「讯号接收极板,signal receiver plates」上产生「影像电流,image current」,处理此影像电流可得到一类比电子讯号,以傅立叶转换运算此讯号后,即可得到这个离子质量大小以及相对强度的讯息,并换算成质谱图。傅立叶质量分析器具有相当高的解析度以及准确度,并可加入激发源进行大分子生化样品高能量解离实验,以得到更多结构上的讯息
串联式质谱法(tandem mass spectrometry,或简写为 MSMS)
除了质量的测量外,另一种质谱法是利用分析物的碎片段进行质量测量,称为「串联式质谱法」。顾名思义,「串联式质谱仪,tandem mass spectrometer,或简写为 MSMS」是由两个以上的质谱分析器在空间上或时间上联结在一起,所组成的质谱仪器,当分析物经过离子源游离后,第一段质量分析器可以从混合物中选择欲研究的离子作为「母离子,parent ion」,经过分离后进入一个碰撞室,以外力(碰撞气体、光子、电子等)使该母离子进行诱导碰撞解离(CID),并产生碎片离子,最后由第二段质量分析器进行碎片离子的质量分析。这些碎片资讯可以用来分析胜肽序列、醣、核酸等生物分子的结构鉴定。

质谱仪输出解析
当我们面对质谱时,逆 Diehls-Alder 反应和均裂/异裂释放的能量被用来解离或断裂化学键,产生特征碎裂,是我们思考的基础。质谱图显示出试验中特定时间出现的特有离子,持续时间表示固体样品在离子源长时间的烧蚀,或表示短暂的 GC LC 峰的通过。然而,对绝大多数质谱仪,m/z 的上限介于 650-800。因此,在那些解吸电离技术出现前,名义质量和整数单同位素质量是相同的数值,离子、分子或自由基的单同位素质量是其元素组成中元素的单同位素质量的总和。元素的单同位素质量是最大丰度、自然存在、稳定同位素的精确质量。在解吸电离时代开始的时候,对较大分子和更高精确度的研究成为一个整体,因为技术不存在任何困难。仅在那个时侯,质量缺失的问题变得非常重要。在仅能测定最接近整数 m/z 值的质谱仪上, 化合物的分子离子可以由 m/z 703 的峰表示,不是 m/z 702,因为分子离子的单同位素质量为 702.7825,取整的整数为 703
500Da 以上的测定中,在确定 MS 峰的 m/z 值时,质量缺失可能是个严重的问题。需要记住,不管使用什么 m/z 分析器类型,质谱仪是测量质谱采集过程中特定时间出现的信号强度。测得的 m/z 值是特定化合物产生的已知 m/z 值离子相对于校正化合物到达检测器时间的函数。因为单同位素离子的质量随 m/z 刻度位置的变化而改变,得出 m/z 整数值的质谱仪实际上能够每隔 0.05m/z 单位进行测量。检测强度可以是质谱峰的顶点值或整个质谱峰的强度之和,测得的 m/z 值是对质量波谱峰最大值,实测 m/z 值取整数
电子电离质谱通常取决于全氟化合物,比如过氟三丁烷胺(名义分子量为 671),以校正 m/z 刻度。这是因为离子的整数质量几乎与其同位素质量相同。一旦离子的名义质量超过 1,000Da,在质谱图上没有实测的名义 m/z 值的峰。在此应当按与离子质量亏损相等的量检测名义质量峰,弥补单一同位素质量峰的缺失。对带单个电荷的离子,质量大于 500Da,使用像电喷雾离子化结合四级杆或四级离子阱质谱技术,这类质谱仪在整个 m/z 刻度上具有单位分辨率,同位素峰可以清楚的分离。

分类:科普 >>表征 >>仪器
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发表于 2024-10-13 07:04 | 显示全部楼层
类似于有机化学反应机理;质谱碎裂多数有两个原则:

  • 产生的碎片能量最低;
  • 碎片的产生过程耗能最低;
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发表于 2024-10-13 07:05 | 显示全部楼层
比较复杂,需要较好的化学背景。简单说,靠分子量和碎片进行解谱。复杂说,还需要结合其他光谱色谱,首先判断类型,再进行解谱。完全未知时,依靠来源,前体信息,或文献资料。不过有单体物质,量又足够多,还是用NMR解谱。
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